MYEOV是分化角膜上皮的新型标志物

MYEOV Is a Novel Marker of Differentiated Corneal Epithelium

作者信息Yoshiko Fukuda, Chao Zhang, Bruce R Ksander, Vickie Y Jo, Christine G Lian, George F Murphy, Markus H Frank, Natasha Y Frank, Yuzuru Sasamoto
PMID41186354
发布时间2025-11-03
DOI10.1167/iovs.66.14.7

实验完整度

包含人角膜免疫染色、scRNA-seq数据分析、siRNA敲低、western blot、集落形成、EdU、RNA-seq等多层级验证,且包含功能与机制验证。

主要模型

人角膜组织 体外培养人角膜上皮细胞 3T3-J2饲养层细胞

重点核对

MYEOV在KRT12阳性角膜上皮细胞中高表达,在结膜上皮中阴性 PAX6和KLF4敲低后MYEOV蛋白表达降低 MYEOV敲低降低细胞增殖(集落形成效率及EdU阳性率) KLF4结合位点存在于MYEOV启动子/增强子区域

摘要

目的:骨髓瘤过表达基因(MYEOV)最初被鉴定为在多种恶性肿瘤中扩增的基因,并发现其促进细胞增殖和转移。我们之前的比较RNA测序和表观遗传学分析显示,MYEOV在分化的角膜上皮细胞中高表达,并表明TET2表观遗传调控MYEOV表达。在本研究中,我们旨在进一步表征MYEOV在人眼表面的表达和调控。方法:通过人角膜免疫染色和公开可用的单细胞RNA测序数据分析检测MYEOV表达。使用siRNA转染在体外扩增的角膜上皮细胞中进行MYEOV及角膜上皮分化调节因子PAX6和KLF4的基因敲低(KD)。通过蛋白质印迹检测蛋白表达水平。对MYEOV KD细胞进行集落形成和EdU细胞增殖实验及RNA测序分析。结果:人角膜免疫染色显示,在KRT12阳性的分化角膜上皮细胞中MYEOV强表达,而大多数KRT13阳性的分化结膜上皮细胞为MYEOV阴性。在其他表面外胚层来源的上皮(如皮肤和口腔黏膜)中未检测到MYEOV表达。PAX6 KD和KLF4 KD均导致MYEOV和KRT12蛋白表达降低。MYEOV KD降低细胞增殖。结论:我们的研究揭示了在表面外胚层来源的上皮中,MYEOV在KRT12阳性角膜上皮细胞中特异性高表达。与KRT12类似,MYEOV表达受PAX6和KLF4调控。功能上,MYEOV调节角膜中瞬时扩增细胞的增殖。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
MYEOV在人眼表面的表达模式及其调控机制和功能是什么?
核心机制
MYEOV表达受转录因子PAX6和KLF4调控,其中KLF4可能直接结合MYEOV启动子/增强子区域;MYEOV可能通过调控IGFBPL1、PPP2R1B和CHCHD10等基因影响细胞增殖。
主要证据
人角膜免疫染色显示MYEOV在KRT12阳性角膜上皮细胞中高表达;PAX6和KLF4敲低导致MYEOV蛋白下调;MYEOV敲低降低集落形成效率和EdU阳性率。
研究意义
MYEOV可作为角膜上皮分化的新型标志物,可与KRT12联合用于角膜上皮发育研究、眼表结膜化诊断及胚胎干细胞/诱导多能干细胞分化为角膜上皮细胞的研究。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

表达模式分析

确定MYEOV在人角膜、结膜、皮肤和口腔黏膜中的表达分布

对人角膜、结膜、皮肤和口腔黏膜组织进行免疫荧光染色,分析MYEOV与KRT12、KRT13、KRT10、KRT14的共表达情况;并重新分析公开的scRNA-seq数据(GSE155683)以验证MYEOV在细胞类型的表达。

2

转录因子调控分析

验证PAX6和KLF4是否调控MYEOV表达

在培养的人角膜上皮细胞中转染PAX6或KLF4的特异性siRNA,通过qPCR和western blot检测MYEOV和KRT12的表达变化,并利用JASPAR和ReMap数据库预测KLF4结合位点。

3

功能分析

评估MYEOV敲低对角膜上皮细胞增殖的影响

使用两种MYEOV特异性siRNA敲低角膜上皮细胞中的MYEOV,通过集落形成实验和EdU掺入实验评估细胞增殖能力,并进行RNA-seq分析全局基因表达变化。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
抗MYEOV多克隆抗体Atlas AntibodiesHPA012949
抗KRT12单克隆抗体Santa Cruz Biotechnologysc-515882
抗KRT13多克隆抗体Thermo Fisher ScientificPA5-19049
抗KRT10单克隆抗体Santa Cruz Biotechnologysc-23877
抗KRT14多克隆抗体Santa Cruz Biotechnologysc-53253
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific--
ProLong Gold防淬灭封片剂Thermo Fisher Scientific--
C2+共聚焦显微镜Nikon--
PluriSTEM Dispase II溶液MilliporeSigma--
TrypLE Express酶Thermo Fisher Scientific--
DMEM/F-12培养基Thermo Fisher Scientific--
角质形成细胞生长因子PeproTech--
Y-27632Tocris Bioscience--
B-27补充剂Thermo Fisher Scientific--
3T3-J2细胞系Kerafast--
Lipofectamine RNAiMAX转染试剂Thermo Fisher Scientific--
Silencer Select阴性对照1号siRNAThermo Fisher Scientific--
RNeasy Plus微型试剂盒QIAGEN--
High-Capacity cDNA逆转录试剂盒Thermo Fisher Scientific--
TaqMan快速通用PCR预混液Thermo Fisher Scientific--
TaqMan基因表达分析探针Thermo Fisher Scientific--
StepOnePlus实时荧光定量PCR系统Thermo Fisher Scientific--
RIPA裂解缓冲液Cell Signaling Technology--
cOmplete蛋白酶抑制剂混合物MilliporeSigma--
Bio-Rad蛋白测定试剂盒Bio-Rad Laboratories--
抗β-肌动蛋白多克隆抗体Cell Signaling Technology5125
抗MYEOV多克隆抗体MyBioSourceMBS9611913
抗KRT12单克隆抗体Abcamab185627
抗PAX6单克隆抗体Abcamab195045
抗KLF4单克隆抗体Santa Cruz Biotechnologysc-166238
罗丹明BMilliporeSigma--
Click-iT Plus EdU流式细胞术检测试剂盒Thermo Fisher Scientific--
FACSymphony A3流式细胞仪BD Biosciences--
DNA-free DNA去除试剂盒Thermo Fisher Scientific--
Zymo-Seq RiboFree总RNA文库制备试剂盒Zymo Research--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
免疫荧光染色
抗体稀释比例、组织固定和抗原修复条件
阅读提示:Materials and Methods 中的 Immunofluorescence Staining 部分
细胞培养
供体角膜来源、细胞培养条件(DMEM/F-12、KGF、Y-27632、B-27补充剂)及使用代数
阅读提示:Materials and Methods 中的 Human Cell Source 部分
RNA干扰
siRNA序列和转染条件
阅读提示:Materials and Methods 中的 RNA Interference 部分
RT-qPCR
所用引物探针(TaqMan)、内参基因(GAPDH)、循环条件
阅读提示:Materials and Methods 中的 Reverse Transcription and Quantitative PCR 部分
Western blot
抗体稀释比例、蛋白上样量、膜类型和曝光条件
阅读提示:Materials and Methods 中的 Western Blot Analyses 部分
集落形成实验
细胞接种密度、培养时间、饲养层细胞处理
阅读提示:Materials and Methods 中的 Colony-Forming Assay 部分
细胞增殖实验
EdU浓度和孵育时间
阅读提示:Materials and Methods 中的 Cell Proliferation Assay 部分
RNA测序
RNA质量控制、文库制备方法、测序深度、差异表达分析流程
阅读提示:Materials and Methods 中的 RNA Sequencing 部分