表达模式分析
确定MYEOV在人角膜、结膜、皮肤和口腔黏膜中的表达分布
对人角膜、结膜、皮肤和口腔黏膜组织进行免疫荧光染色,分析MYEOV与KRT12、KRT13、KRT10、KRT14的共表达情况;并重新分析公开的scRNA-seq数据(GSE155683)以验证MYEOV在细胞类型的表达。
MYEOV Is a Novel Marker of Differentiated Corneal Epithelium
包含人角膜免疫染色、scRNA-seq数据分析、siRNA敲低、western blot、集落形成、EdU、RNA-seq等多层级验证,且包含功能与机制验证。
人角膜组织 体外培养人角膜上皮细胞 3T3-J2饲养层细胞
MYEOV在KRT12阳性角膜上皮细胞中高表达,在结膜上皮中阴性 PAX6和KLF4敲低后MYEOV蛋白表达降低 MYEOV敲低降低细胞增殖(集落形成效率及EdU阳性率) KLF4结合位点存在于MYEOV启动子/增强子区域
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定MYEOV在人角膜、结膜、皮肤和口腔黏膜中的表达分布
对人角膜、结膜、皮肤和口腔黏膜组织进行免疫荧光染色,分析MYEOV与KRT12、KRT13、KRT10、KRT14的共表达情况;并重新分析公开的scRNA-seq数据(GSE155683)以验证MYEOV在细胞类型的表达。
验证PAX6和KLF4是否调控MYEOV表达
在培养的人角膜上皮细胞中转染PAX6或KLF4的特异性siRNA,通过qPCR和western blot检测MYEOV和KRT12的表达变化,并利用JASPAR和ReMap数据库预测KLF4结合位点。
评估MYEOV敲低对角膜上皮细胞增殖的影响
使用两种MYEOV特异性siRNA敲低角膜上皮细胞中的MYEOV,通过集落形成实验和EdU掺入实验评估细胞增殖能力,并进行RNA-seq分析全局基因表达变化。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫荧光染色 | 抗MYEOV多克隆抗体 | Atlas Antibodies | HPA012949 |
| 抗KRT12单克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-515882 | |
| 抗KRT13多克隆抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-19049 | |
| 抗KRT10单克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-23877 | |
| 抗KRT14多克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ProLong Gold防淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| C2+共聚焦显微镜 | Nikon | -- | |
| 细胞培养 | PluriSTEM Dispase II溶液 | MilliporeSigma | -- |
| TrypLE Express酶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| DMEM/F-12培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 角质形成细胞生长因子 | PeproTech | -- | |
| Y-27632 | Tocris Bioscience | -- | |
| B-27补充剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 3T3-J2细胞系 | Kerafast | -- | |
| RNA干扰 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Silencer Select阴性对照1号siRNA | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RT-qPCR | RNeasy Plus微型试剂盒 | QIAGEN | -- |
| High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TaqMan快速通用PCR预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TaqMan基因表达分析探针 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| StepOnePlus实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | Cell Signaling Technology | -- |
| cOmplete蛋白酶抑制剂混合物 | MilliporeSigma | -- | |
| Bio-Rad蛋白测定试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| 抗β-肌动蛋白多克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 5125 | |
| 抗MYEOV多克隆抗体 | MyBioSource | MBS9611913 | |
| 抗KRT12单克隆抗体 | Abcam | ab185627 | |
| 抗PAX6单克隆抗体 | Abcam | ab195045 | |
| 抗KLF4单克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166238 | |
| 集落形成实验 | 罗丹明B | MilliporeSigma | -- |
| 细胞增殖实验 | Click-iT Plus EdU流式细胞术检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| FACSymphony A3流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| RNA测序 | DNA-free DNA去除试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Zymo-Seq RiboFree总RNA文库制备试剂盒 | Zymo Research | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 免疫荧光染色 | 抗体稀释比例、组织固定和抗原修复条件 阅读提示:Materials and Methods 中的 Immunofluorescence Staining 部分 |
| 细胞培养 | 供体角膜来源、细胞培养条件(DMEM/F-12、KGF、Y-27632、B-27补充剂)及使用代数 阅读提示:Materials and Methods 中的 Human Cell Source 部分 |
| RNA干扰 | siRNA序列和转染条件 阅读提示:Materials and Methods 中的 RNA Interference 部分 |
| RT-qPCR | 所用引物探针(TaqMan)、内参基因(GAPDH)、循环条件 阅读提示:Materials and Methods 中的 Reverse Transcription and Quantitative PCR 部分 |
| Western blot | 抗体稀释比例、蛋白上样量、膜类型和曝光条件 阅读提示:Materials and Methods 中的 Western Blot Analyses 部分 |
| 集落形成实验 | 细胞接种密度、培养时间、饲养层细胞处理 阅读提示:Materials and Methods 中的 Colony-Forming Assay 部分 |
| 细胞增殖实验 | EdU浓度和孵育时间 阅读提示:Materials and Methods 中的 Cell Proliferation Assay 部分 |
| RNA测序 | RNA质量控制、文库制备方法、测序深度、差异表达分析流程 阅读提示:Materials and Methods 中的 RNA Sequencing 部分 |