检测S100A8/A9在SjDED患者和小鼠中的表达
明确S100A8/A9在SjDED中的表达变化及其与疾病严重程度的关系。
通过qRT-PCR和Western blot检测SjDED患者PBMCs和不同周龄NOD小鼠泪腺中S100A8和S100A9的表达，并分析其与临床指标（OSDI评分、泪液分泌）和炎症浸润的相关性。
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S100A8/A9通过调节Acod1/STAT3通路促进干燥综合征干眼病中树突状细胞介导的Th17细胞反应
S100A8/A9 Promotes Dendritic Cell-Mediated Th17 Cell Response in Sjögren's Dry Eye Disease by Regulating the Acod1/STAT3 Pathway
实验完整度
高包含患者样本表达检测、NOD小鼠体内干预、体外细胞共培养及信号通路机制验证等多层级实验。
主要模型
NOD小鼠SjDED模型 BALB/c小鼠（健康对照） NOD小鼠来源的CD4+T细胞和BMDCs 患者PBMCs
重点核对
SjDED模型：雌性NOD/ShiLtJ小鼠，4-24周龄，16周时疾病完全建立 paquinimod剂量：25 mg/kg，腹腔注射，隔日一次，持续28天 colivelin剂量：2 mg/kg，于paquinimod给药后第14天和第21天给予 S100A8/A9重组蛋白浓度：4 μg/mL，处理BMDCs 24小时 Th17极化条件：anti-CD3/anti-CD28（5 μg/mL），anti-IL-4（10 μg/mL），anti-IFN-γ（10 μg/mL），TGF-β（5 ng/mL），IL-6（40 ng/mL），IL-23（20 ng/mL）
摘要
目的：探讨S100A8/A9在干燥综合征干眼病（SjDED）发病机制中的作用，并探索其潜在的作用机制。方法：通过Western blot和实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测S100A8/A9的表达。使用泪液分泌、角膜荧光素染色和HE染色评估S100A8/A9抑制剂paquinimod对非肥胖糖尿病（NOD）小鼠干眼病的作用。通过免疫荧光和流式细胞术评估免疫细胞浸润和百分比。通过qRT-PCR或ELISA检测促炎细胞因子水平。通过Western blot、免疫荧光和染色质免疫沉淀分析作用机制。结果：S100A8/A9在SjDED患者外周血单核细胞（PBMCs）和SjDED小鼠泪腺（LGs）中表达上调。S100A8/A9的上调与干眼严重程度和泪腺炎症浸润水平相关。给予paquinimod可改善SjDED小鼠的临床和组织病理学表型，并降低泪腺、淋巴结和脾脏中Th17细胞的比例。进一步实验显示，S100A8/A9不直接影响Th17细胞的生成和功能，但上调树突状细胞（DCs）中主要组织相容性复合体Ⅱ类（MHC Ⅱ）和Th17极化细胞因子的表达，从而增强Th17细胞反应。机制上，S100A8/A9诱导Acod1表达，进而促进信号转导和转录激活因子3（STAT3）的活化和核转位，导致Il23a转录增加。STAT3激动剂逆转了paquinimod对SjDED小鼠的治疗效果。结论：S100A8/A9激活Acod1/STAT3通路促进DCs驱动的Th17细胞反应，从而参与SjDED的发生发展。S100A8/A9/Acod1/STAT3通路可能成为SjDED有前景的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- S100A8/A9在干燥综合征干眼病发病机制中的作用及其下游机制是什么？
- 核心机制
- S100A8/A9通过诱导Acod1表达，进而促进STAT3的活化和核转位，上调DC中Il23a的转录，从而增强DC介导的Th17细胞反应，促进SjDED的进展。
- 主要证据
- 体外实验显示S100A8/A9处理BMDCs可上调MHC II和Th17极化细胞因子（Il23a, Il6, Il1b）及趋化因子（Cxcl1, Cxcl2, Cxcl3）表达；敲低Acod1可逆转S100A8/A9诱导的p-STAT3上调及Il23a和Il6表达；STAT3抑制剂可阻断S100A8/A9对DC介导Th17反应的促进作用；ChIP实验证实p-STAT3结合Il23a启动子；体内实验显示paquinimod抑制S100A8/A9后STAT3活性降低，Th17细胞比例减少，而STAT3激动剂colivelin逆转了paquinimod的治疗效果。
- 研究意义
- 该研究揭示了S100A8/A9在SjDED中通过Acod1/STAT3通路调控DC介导Th17反应的新机制，提示S100A8/A9可能成为SjDED的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内评估S100A8/A9抑制剂的治疗效果
验证抑制S100A8/A9是否能缓解SjDED小鼠的疾病表现。
对16周龄NOD小鼠腹腔注射paquinimod（25 mg/kg）或溶剂，隔日一次，持续28天。期间评估角膜荧光素染色评分、泪液分泌量；实验结束后取泪腺、脾脏和淋巴结进行组织学和免疫细胞分析。
体外验证S100A8/A9对Th17细胞分化的直接作用
确定S100A8/A9是否直接影响CD4+T细胞的Th17分化。
从NOD小鼠脾脏和淋巴结分离CD4+T细胞，在Th17极化条件下用重组S100A8/A9蛋白或溶剂处理，3天后检测Th17细胞比例和IL-17分泌。
验证S100A8/A9通过DC促进Th17反应
确认S100A8/A9是否通过作用于DC来影响Th17细胞反应。
用重组S100A8/A9蛋白或溶剂处理BMDCs 24小时，洗涤后与CD4+T细胞共培养（1:20）在Th17极化条件下，检测Th17细胞比例、IL-17分泌、Th17相关基因表达及T细胞增殖。
探索S100A8/A9促进DC活化的分子机制
识别S100A8/A9影响DC功能的关键分子和信号通路。
对S100A8/A9处理或溶剂处理的BMDCs进行RNA-seq分析，筛选差异表达基因，并进行qRT-PCR验证。进一步通过siRNA敲低Acod1，检测DC中促炎因子表达和STAT3/JAK2磷酸化水平。
验证STAT3通路在DC介导Th17反应中的作用
确定STAT3信号是否介导S100A8/A9对DC功能及Th17反应的促进作用。
使用STAT3抑制剂Stattic预处理的DC在S100A8/A9刺激后与CD4+T细胞共培养，评估Th17反应；并检测DC中Il23a、MHC II表达变化。同时通过ChIP实验检测p-STAT3与Il23a启动子的结合。
体内验证STAT3激活对paquinimod治疗效果的影响
验证STAT3活化是否能逆转paquinimod对SjDED的治疗效果，确认STAT3在通路中的关键作用。
NOD小鼠分组：paquinimod+colivelin组、paquinimod组、对照组。按方案给药后评估角膜荧光素染色、泪液分泌、泪腺炎症及脾脏和淋巴结中DC和Th17细胞比例。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 帕喹莫德 | TargetMol Chemicals | T7310 |
| Colivelin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361153 | |
| 细胞培养 | 重组小鼠S100A8/A9 | R&D Systems | 8916-S8 |
| 重组小鼠TGF-β | R&D Systems | 7666-MB | |
| 重组小鼠IL-6 | R&D Systems | 406-ML | |
| 重组小鼠IL-23 | R&D Systems | 1887-ML | |
| 重组小鼠IL-4 | R&D Systems | 404-ML | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | R&D Systems | 415-ML | |
| 抗小鼠CD3抗体 | eBioscience | 16-0031-86 | |
| 抗小鼠CD28抗体 | eBioscience | 16-0281-86 | |
| 抗IL-4中和抗体 | eBioscience | 16-7041-85 | |
| 抗IFN-γ中和抗体 | eBioscience | 16-7312-85 | |
| 共培养 | 抗IL-23 p19中和抗体 | eBioscience | 14-7232-85 |
| 细胞分离 | Ficoll梯度离心 | -- | -- |
| PE抗小鼠CD4抗体 | -- | -- | |
| 抗PE微珠 | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| MACS分离器 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 细胞培养 | 二甲基亚砜 | Solarbio | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| CFSE染色 | 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA-seq | SuperScript II逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Agilent 4200 TapeStation系统 | Agilent Technologies | -- | |
| Illumina测序平台 | Illumina | -- | |
| ELISA | 小鼠IL-17 DuoSet ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY421 |
| 底物试剂盒 | R&D Systems | DY999 | |
| Spark 10 M发光检测仪 | Tecan | -- | |
| 流式细胞术 | Fc阻断抗体 | BioLegend | 156604 |
| 佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 离子霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 布雷菲德菌素A | Sigma-Aldrich | -- | |
| eBioscience胞内固定和透化缓冲液套装 | eBioscience | -- | |
| FACS Calibur流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| qRT-PCR | EZ-press RNA纯化试剂盒 | EZBioscience | -- |
| RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| FastStart Universal SYBR Green Master | Roche | 04913914001 | |
| LightCycler 480实时荧光定量PCR系统 | Roche | -- | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解缓冲液 | Beyotime | -- |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio | -- |
| Western blot | PVDF膜 | -- | -- |
| ECL发光液 | Cytiva | -- | |
| 4800化学发光成像系统 | Tanon | -- | |
| 免疫荧光 | 磷酸盐缓冲液吐温 | Solarbio | P1031 |
| 山羊血清 | Solarbio | SL038 | |
| 抗p-STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 9145 | |
| 山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150079 | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | Sigma-Aldrich | -- | |
| LSM 800共聚焦显微镜 | ZEISS | -- | |
| ChIP | 染色质免疫沉淀试剂盒 | Abcam | ab500 |
| 蛋白A琼脂糖珠 | -- | -- | |
| 组织学分析 | MICRON IV生物显微镜 | Phoenix Research Labs | -- |
| BX51荧光显微镜 | Olympus Corporation | -- | |
| ImageJ软件 | National Institutes of Health | -- | |
| 统计分析 | Prism 8 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本采集 | 患者诊断标准（TFOS DEWS II和2016 ACR/EULAR标准）、样本量（非SjDED n=7，SjDED n=8）、性别、年龄 阅读提示：Methods: Patients |
| 动物模型建立 | 小鼠品系（NOD/ShiLtJ）、年龄（4-24周）、饲养条件（SPF）、性别匹配 阅读提示：Methods: Mice |
| 药物处理 | paquinimod剂量（25 mg/kg）、给药方式（腹腔注射）、给药频率（隔日一次）、持续时间（28天） 阅读提示：Methods: Administration of S100A8/A9 Inhibitor |
| 细胞培养 | BMDC诱导条件（GM-CSF和IL-4浓度）、处理时间（24小时）、S100A8/A9浓度（4 μg/mL） 阅读提示：Methods: Generation and Transfection of Bone Marrow–Derived DCs |
| Th17极化 | 细胞因子浓度（TGF-β 5 ng/mL, IL-6 40 ng/mL, IL-23 20 ng/mL）、中和抗体浓度（anti-IL-4, anti-IFN-γ 10 μg/mL）、共培养比例（1:20） 阅读提示：Methods: CD4+T Cell Isolation and Polarization; Co-Culture of CD4+T Cells and DCs |
| 信号通路验证 | STAT3抑制剂Stattic浓度、处理时间（1小时）、siRNA序列、转染时间（24小时） 阅读提示：Methods: Generation and Transfection of Bone Marrow–Derived DCs; Figure 7 legend |