表达与定位分析
检测SMIM20/PNX-14和GPR173在猪黄体中的表达及其在发情周期中的变化
收集发情周期第2-3、10-12、14-16天黄体组织,进行RT-qPCR、Western blot和免疫组化分析
Phoenixin-14 as a novel direct regulator of porcine luteal cell functions†
包含体内表达分析(发情周期各阶段黄体组织)、体外细胞培养功能实验、信号通路抑制剂和siRNA基因沉默验证,多层级证据。
猪黄体细胞(体外培养) 猪黄体组织(发情周期不同阶段)
黄体细胞分离自猪发情周期第10-12天,培养于含10% FBS的M199培养基 PNX-14处理浓度范围1-1000 nM,LH浓度为100 ng/mL GPR173 siRNA转染浓度2 nM,ERK1/2抑制剂PD98059浓度50 μM 检测指标包括P4、E2、PGE2、PGF2α分泌水平及相关基因和蛋白表达
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测SMIM20/PNX-14和GPR173在猪黄体中的表达及其在发情周期中的变化
收集发情周期第2-3、10-12、14-16天黄体组织,进行RT-qPCR、Western blot和免疫组化分析
检测胰岛素、LH、P4、PGE2和PGF2α对SMIM20表达和PNX分泌的影响
培养黄体细胞,分别用胰岛素、LH、P4、PGE2和PGF2α处理24小时,检测SMIM20 mRNA水平和培养基中PNX浓度
评估PNX-14对黄体细胞类固醇激素分泌和类固醇生成酶表达的影响
用不同浓度PNX-14(1-1000 nM)单独或与LH联合处理黄体细胞,检测P4和E2分泌量及STAR、CYP11A1、HSD3B、CYP19A1、LHCGR的表达
评估PNX-14对黄体细胞前列腺素分泌及其受体表达的影响
用不同浓度PNX-14处理黄体细胞,检测PGE2和PGF2α分泌量及PTGER2和PTGFR的表达
检测PNX-14对黄体细胞中GPR173表达和多种蛋白激酶磷酸化的影响
用10 nM PNX-14处理黄体细胞不同时间,检测GPR173蛋白水平及ERK1/2、PKA、AKT、AMPKα、PKC的磷酸化水平
验证GPR173、ERK1/2和PKA在PNX-14调节类固醇和前列腺素分泌中的作用
使用GPR173 siRNA敲低、ERK1/2抑制剂PD98059和PKA抑制剂KT5720预处理黄体细胞,再与PNX-14共处理,检测P4、E2、PGE2和PGF2α分泌量
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | M199培养基 | Sigma-Aldrich | M2154 |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| 猪Phoenixin-14酰胺 | Phoenix Pharmaceuticals Inc. | 079-01 | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| 促黄体激素 | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| 孕酮 | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| 前列腺素E2 | Sigma-Aldrich | P0409 | |
| 前列腺素F2α | Sigma-Aldrich | P5069 | |
| 牛血清白蛋白 | BioShop | ALB001 | |
| 抗生素-抗真菌溶液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 胰蛋白酶 | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
| 药物处理 | PD98059 | Tocris | 1213 |
| KT5720 | Sigma-Aldrich | K3761 | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| RT-qPCR | iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad | -- |
| MYIQ Cycler实时荧光定量PCR系统 | Bio-Rad | -- | |
| TaqMan实时PCR | TaqMan基因表达Cells-to-CT试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | AM1728 |
| StepOnePlus系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | WesternBright Sirius HRP底物 | -- | -- |
| Chemidoc XRS+系统 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫组织化学 | Vectastain Elite ABC试剂 | Vector Laboratories | -- |
| DPX封片剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Nikon Eclipse Ni-U显微镜 | Nikon | -- | |
| ELISA | Phoenixin ELISA试剂盒 | Phoenix Pharmaceuticals | EK-079-01 |
| 孕酮ELISA试剂盒 | DRG Instruments GmbH | EIA-1561 | |
| 雌二醇ELISA试剂盒 | DRG Instruments GmbH | EIA-2693 | |
| 前列腺素E2 ELISA试剂盒 | FineTest | EP0205 | |
| 前列腺素F2α ELISA试剂盒 | FineTest | EP0206 | |
| 基因沉默 | Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 |
| Western blot | Phoenixin-14抗体 | Phoenix Pharmaceuticals | G-079-01 |
| GPR173抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-50976 | |
| STAR抗体 | Abcam | ab233427 | |
| CYP11A1抗体 | Abcam | ab175408 | |
| HSD3B抗体 | Abcam | ab75710 | |
| CYP19A1抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA1-21398 | |
| LHCGR抗体 | ProteinTech | 19968-1-AP | |
| PTGER2抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-91872 | |
| PTGFR抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-70674 | |
| 磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9101S | |
| ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9102S | |
| 磷酸化PKA抗体 | Abcam | ab5815 | |
| PKA抗体 | Abcam | ab187515 | |
| 磷酸化AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9271S | |
| AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9272S | |
| 磷酸化AMPK抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-17831 | |
| AMPK抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-17398 | |
| 磷酸化PKC抗体 | Abcam | ab180848 | |
| PKC抗体 | Abcam | ab32376 | |
| 肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A5316 | |
| 抗兔HRP偶联抗体 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 抗小鼠HRP偶联抗体 | Cell Signaling Technology | 7076 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样品采集 | 猪品种、年龄、体重;黄体阶段确认方法 阅读提示:Materials and methods: Sample collection and in vitro experiments |
| 细胞培养 | 细胞分离方法、培养基成分、细胞密度、培养时间 阅读提示:Materials and methods: Sample collection and in vitro experiments |
| 激素处理 | 胰岛素、LH、P4、PGE2、PGF2α的剂量和处理时间 阅读提示:Materials and methods: Experiment 1 |
| PNX-14处理 | PNX-14浓度范围、处理时间、是否与LH联合 阅读提示:Materials and methods: Experiment 2 |
| 信号通路抑制 | siRNA浓度、抑制剂浓度、预处理时间 阅读提示:Materials and methods: Experiment 4 |
| 基因表达检测 | RNA提取方法、逆转录条件、qPCR条件、内参基因 阅读提示:Materials and methods: RNA isolation and real-time PCR |
| 蛋白表达检测 | 蛋白提取方法、上样量、抗体稀释度、曝光条件 阅读提示:Materials and methods: Western blot |