Phoenixin-14作为猪黄体细胞功能的新型直接调节因子

Phoenixin-14 as a novel direct regulator of porcine luteal cell functions†

作者信息Ewa Mlyczyńska, Patrycja Kurowska, Dominika Wachowska, Małgorzata Grzesiak, Joelle Dupont, Agnieszka Rak
PMID37815939
发布时间2024-01-13
DOI10.1093/biolre/ioad138

实验完整度

高

包含体内表达分析(发情周期各阶段黄体组织)、体外细胞培养功能实验、信号通路抑制剂和siRNA基因沉默验证,多层级证据。

主要模型

猪黄体细胞(体外培养) 猪黄体组织(发情周期不同阶段)

重点核对

黄体细胞分离自猪发情周期第10-12天,培养于含10% FBS的M199培养基 PNX-14处理浓度范围1-1000 nM,LH浓度为100 ng/mL GPR173 siRNA转染浓度2 nM,ERK1/2抑制剂PD98059浓度50 μM 检测指标包括P4、E2、PGE2、PGF2α分泌水平及相关基因和蛋白表达

摘要

Phoenixin是一种在生殖过程的中枢调节中具有公认作用的神经肽;然而,关于其在卵巢中的作用的知识有限。主要的活性phoenixin亚型之一是phoenixin-14,它通过G蛋白偶联受体173发挥作用。我们的研究假设是,phoenixin-14在猪黄体中表达,并通过G蛋白偶联受体173和蛋白激酶信号传导影响黄体细胞的内分泌功能,从而发挥促黄体作用。培养黄体细胞以研究phoenixin-14(1–1000 nM)对内分泌功能的影响。我们发现,phoenixin-14和G蛋白偶联受体173在猪黄体中局部产生,其水平在发情周期中发生变化。我们在细胞质中检测到phoenixin-14免疫染色,在细胞膜上检测到G蛋白偶联受体173。血浆phoenixin水平在黄体早期最高。有趣的是,胰岛素、促黄体激素、孕酮和前列腺素降低了黄体细胞中的phoenixin-14水平。Phoenixin-14增加了孕酮、雌二醇和前列腺素E2的分泌,但减少了前列腺素F2α,上调了类固醇生成酶的表达,并下调了促黄体激素和前列腺素的受体。此外,phoenixin-14增加了G蛋白偶联受体173的表达和细胞外信号调节激酶1/2、蛋白激酶B的磷酸化,抑制了蛋白激酶A的磷酸化,并对AMP激活的蛋白激酶α和蛋白激酶C产生了混合效应。G蛋白偶联受体173和细胞外信号调节激酶1/2介导了phoenixin-14对黄体细胞内分泌功能的影响。我们的结果表明,phoenixin由猪黄体细胞产生,并且可以成为其功能的新调节因子。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
Phoenixin-14是否在猪黄体中表达并通过GPR173和蛋白激酶信号通路调节黄体细胞的内分泌功能
核心机制
PNX-14通过GPR173受体和ERK1/2信号通路刺激类固醇和PGE2合成,同时抑制PGF2α分泌,发挥促黄体作用
主要证据
猪黄体细胞体外培养实验,PNX-14处理增加P4、E2、PGE2分泌,减少PGF2α,上调类固醇生成酶表达;siRNA沉默GPR173或抑制ERK1/2阻断其效应
研究意义
PNX-14是猪黄体细胞的新型促黄体因子,可能用于调节家畜生殖功能和治疗黄体期缺陷

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

表达与定位分析

检测SMIM20/PNX-14和GPR173在猪黄体中的表达及其在发情周期中的变化

收集发情周期第2-3、10-12、14-16天黄体组织,进行RT-qPCR、Western blot和免疫组化分析

2

激素对PNX的调节

检测胰岛素、LH、P4、PGE2和PGF2α对SMIM20表达和PNX分泌的影响

培养黄体细胞,分别用胰岛素、LH、P4、PGE2和PGF2α处理24小时,检测SMIM20 mRNA水平和培养基中PNX浓度

3

PNX-14对类固醇合成的影响

评估PNX-14对黄体细胞类固醇激素分泌和类固醇生成酶表达的影响

用不同浓度PNX-14(1-1000 nM)单独或与LH联合处理黄体细胞,检测P4和E2分泌量及STAR、CYP11A1、HSD3B、CYP19A1、LHCGR的表达

4

PNX-14对前列腺素合成的影响

评估PNX-14对黄体细胞前列腺素分泌及其受体表达的影响

用不同浓度PNX-14处理黄体细胞,检测PGE2和PGF2α分泌量及PTGER2和PTGFR的表达

5

信号通路激活分析

检测PNX-14对黄体细胞中GPR173表达和多种蛋白激酶磷酸化的影响

用10 nM PNX-14处理黄体细胞不同时间,检测GPR173蛋白水平及ERK1/2、PKA、AKT、AMPKα、PKC的磷酸化水平

6

机制验证

验证GPR173、ERK1/2和PKA在PNX-14调节类固醇和前列腺素分泌中的作用

使用GPR173 siRNA敲低、ERK1/2抑制剂PD98059和PKA抑制剂KT5720预处理黄体细胞,再与PNX-14共处理,检测P4、E2、PGE2和PGF2α分泌量

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
M199培养基Sigma-AldrichM2154
胎牛血清Sigma-AldrichF9665
猪Phoenixin-14酰胺Phoenix Pharmaceuticals Inc.079-01
胰岛素Sigma-AldrichI5523
促黄体激素Sigma-AldrichL6420
孕酮Sigma-AldrichP8783
前列腺素E2Sigma-AldrichP0409
前列腺素F2αSigma-AldrichP5069
牛血清白蛋白BioShopALB001
抗生素-抗真菌溶液Thermo Fisher Scientific--
胰蛋白酶Thermo Fisher Scientific26616
PD98059Tocris1213
KT5720Sigma-AldrichK3761
Trizol试剂Sigma-Aldrich--
iQ SYBR Green SupermixBio-Rad--
MYIQ Cycler实时荧光定量PCR系统Bio-Rad--
TaqMan基因表达Cells-to-CT试剂盒Thermo Fisher ScientificAM1728
StepOnePlus系统Applied Biosystems--
WesternBright Sirius HRP底物----
Chemidoc XRS+系统Bio-Rad--
Vectastain Elite ABC试剂Vector Laboratories--
DPX封片剂Sigma-Aldrich--
Nikon Eclipse Ni-U显微镜Nikon--
Phoenixin ELISA试剂盒Phoenix PharmaceuticalsEK-079-01
孕酮ELISA试剂盒DRG Instruments GmbHEIA-1561
雌二醇ELISA试剂盒DRG Instruments GmbHEIA-2693
前列腺素E2 ELISA试剂盒FineTestEP0205
前列腺素F2α ELISA试剂盒FineTestEP0206
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000001
Phoenixin-14抗体Phoenix PharmaceuticalsG-079-01
GPR173抗体Thermo Fisher ScientificPA5-50976
STAR抗体Abcamab233427
CYP11A1抗体Abcamab175408
HSD3B抗体Abcamab75710
CYP19A1抗体Thermo Fisher ScientificPA1-21398
LHCGR抗体ProteinTech19968-1-AP
PTGER2抗体Thermo Fisher ScientificPA5-91872
PTGFR抗体Thermo Fisher ScientificPA5-70674
磷酸化ERK1/2抗体Cell Signaling Technology9101S
ERK1/2抗体Cell Signaling Technology9102S
磷酸化PKA抗体Abcamab5815
PKA抗体Abcamab187515
磷酸化AKT抗体Cell Signaling Technology9271S
AKT抗体Cell Signaling Technology9272S
磷酸化AMPK抗体Thermo Fisher ScientificPA5-17831
AMPK抗体Thermo Fisher ScientificPA5-17398
磷酸化PKC抗体Abcamab180848
PKC抗体Abcamab32376
肌动蛋白抗体Sigma-AldrichA5316
抗兔HRP偶联抗体Cell Signaling Technology7074
抗小鼠HRP偶联抗体Cell Signaling Technology7076

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
样品采集
猪品种、年龄、体重;黄体阶段确认方法
阅读提示:Materials and methods: Sample collection and in vitro experiments
细胞培养
细胞分离方法、培养基成分、细胞密度、培养时间
阅读提示:Materials and methods: Sample collection and in vitro experiments
激素处理
胰岛素、LH、P4、PGE2、PGF2α的剂量和处理时间
阅读提示:Materials and methods: Experiment 1
PNX-14处理
PNX-14浓度范围、处理时间、是否与LH联合
阅读提示:Materials and methods: Experiment 2
信号通路抑制
siRNA浓度、抑制剂浓度、预处理时间
阅读提示:Materials and methods: Experiment 4
基因表达检测
RNA提取方法、逆转录条件、qPCR条件、内参基因
阅读提示:Materials and methods: RNA isolation and real-time PCR
蛋白表达检测
蛋白提取方法、上样量、抗体稀释度、曝光条件
阅读提示:Materials and methods: Western blot