小鼠模型与组织收集
建立自身免疫性泪腺炎模型并获取泪腺样本以分析miRNA表达。
使用13周龄雄性NOD小鼠作为疾病模型，雄性BALB/c和雌性NOD作为对照；收集泪腺（刺激和未刺激）用于RNA提取和组织学分析。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
自身免疫性泪腺炎小鼠模型泪腺的miRNA图谱
The miRNA Landscape of Lacrimal Glands in a Murine Model of Autoimmune Dacryoadenitis
实验完整度
高包括小RNA测序、RT-qPCR验证、细胞分群分析、公开mRNA-seq数据验证以及Western blot和免疫荧光的蛋白质水平验证，多个证据层级支持结论
主要模型
雄性NOD小鼠泪腺 雄性BALB/c小鼠泪腺（健康对照） 雌性NOD小鼠泪腺（无泪腺炎对照） 免疫细胞富集组分和上皮细胞富集组分
重点核对
小鼠品系和年龄：雄性NOD/ShiLtJ、雄性BALB/cJ、雌性NOD/ShiLtJ，13周龄±3天 泪腺刺激：局部卡巴胆碱处理（剂量未明确说明） 细胞分群：胶原酶I消化，免疫细胞富集组分和上皮细胞富集组分分离 RT-qPCR验证：使用miRCury LNA RT试剂盒和SYBR green试剂盒，内参为Snord68 蛋白质验证：Western blot和免疫荧光检测IL-6Rα和gp130/IL-6st表达
摘要
目的：分析患有自身免疫性泪腺炎的雄性非肥胖糖尿病（NOD）小鼠泪腺（LG）的miRNA组变化，并与健康雄性BALB/c和无泪腺炎的雌性NOD小鼠泪腺进行比较。方法：收集这些小鼠的泪腺进行小RNA测序以识别失调的miRNA；通过RT-qPCR在雄性NOD和BALB/c泪腺中验证命中。通过RT-qPCR探究已验证物种在泪腺免疫细胞富集细胞组分和上皮细胞富集细胞组分中的失调。Ingenuity通路分析确定了推测的miRNA靶标，并在公开的mRNA-seq数据集中进行了检查。Western blotting和免疫荧光的共聚焦成像验证了一些分子在蛋白质水平的变化。结果：雄性NOD泪腺分别表现出15个和13个显著上调和下调的miRNA。通过RT-qPCR验证了其中14个miRNA（9个上调，5个下调）在雄性NOD与BALB/c泪腺中的失调表达。七个上调的miRNA由于其丰富的免疫细胞富集细胞组分而增加，而四个下调的miRNA主要在富含上皮细胞的组分中表达。Ingenuity通路分析预测IL-6和IL-6样通路的上调是miRNA失调的结果。通过mRNA-seq分析证实了这些通路中几个基因的表达增加，而免疫印迹和免疫荧光证实了Ingenuity通路分析预测的IL-6Rα和gp130/IL-6st的变化。结论：雄性NOD小鼠泪腺由于浸润免疫细胞的存在和腺泡细胞含量的减少而表现出多种失调的miRNA。观察到的失调可能增加腺泡上的IL-6Rα和gp130/IL-6st以及特定淋巴细胞上的IL-6Rα，增强IL-6和IL-6样细胞因子信号传导。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 自身免疫性泪腺炎中泪腺miRNA的表达变化及其对疾病机制的影响是什么？
- 核心机制
- miRNA失调（如miR-155-5p上调、miR-200c-3p下调）可能通过靶向IL-6信号通路相关基因，增强IL-6和IL-6样细胞因子信号传导，促进炎症。
- 主要证据
- 小RNA测序鉴定失调miRNA，RT-qPCR验证，免疫细胞/上皮细胞富集分析，IPA预测IL-6通路，mRNA-seq数据验证，Western blot和免疫荧光显示IL-6Rα和gp130/IL-6st蛋白增加。
- 研究意义
- 这些发现可能为干燥综合征的泪腺疾病机制提供新见解，并可能指导针对IL-6通路的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小RNA测序及差异miRNA鉴定
鉴定雄性NOD泪腺中与疾病相关的差异表达miRNA。
对每组小鼠泪腺RNA进行小RNA测序（每个样本由5只小鼠的5个泪腺RNA混合），使用DESeq2分析差异表达。
RT-qPCR验证
验证测序发现的差异miRNA在独立样本中的表达。
对刺激和未刺激的泪腺RNA进行RT-qPCR，使用特异性引物和miRCury LNA试剂盒。
免疫细胞和上皮细胞富集分析
确定失调miRNA的细胞来源。
使用胶原酶消化和过滤分离免疫细胞和上皮细胞，通过RT-qPCR检测miRNA表达和细胞标志物验证富集。
通路预测和mRNA-seq验证
预测失调miRNA的靶向通路，并在公共数据中验证。
使用IPA和Metascape预测靶基因和通路；分析Ohno等人公开的mRNA-seq数据（GEO GSE81621）验证IL-6通路基因表达。
蛋白质水平验证
验证IPA预测的IL-6信号通路蛋白质变化。
通过Western blotting和免疫荧光检测泪腺中IL-6Rα和gp130/IL-6st的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | Universal mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| miRNeasy mini试剂盒 | Qiagen | -- | |
| 细胞消化 | 胶原酶I | -- | -- |
| 细胞活力测定 | 台盼蓝 | -- | -- |
| 小RNA测序 | QIAseq miRNA文库构建试剂盒 | Qiagen | 331502 |
| NextSeq 550测序仪 | Illumina | -- | |
| RT-qPCR | miRCury LNA逆转录试剂盒 | Qiagen | 339340 |
| miRCury LNA SYBR green实时定量PCR试剂盒 | Qiagen | 339345 | |
| miRNA引物 | Qiagen | 339306 | |
| Taqman试剂 | Applied Biosystems | -- | |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物 | Cell Signaling Technology | -- | |
| BeadBug管 | Sigma-Aldrich Corporation | -- | |
| 蛋白质定量 | Micro BCA蛋白质测定试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Western blot | 6X Laemmli SDS上样缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Tris-甘氨酸凝胶 | Thermo Fisher Scientific | XP00105BOX | |
| 硝酸纤维素膜 | Thermo Fisher Scientific | IB23001 | |
| 总蛋白染色 | Li-Cor | 926-11016 | |
| 封闭液 | Rockland | -- | |
| 兔抗gp130/IL-6st抗体 | Cell Signaling Technology | 3732 | |
| 山羊抗IL-6Rα抗体 | R&D Systems | AF1830 | |
| 驴抗兔IR680二抗 | Li-Cor | -- | |
| 驴抗羊IR680二抗 | Li-Cor | -- | |
| Odyssey红外成像系统 | Li-Cor | -- | |
| 免疫荧光 | Superfrost Plus显微载玻片 | VWR | -- |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 驴抗山羊AF 567二抗 | Invitrogen | -- | |
| 驴抗兔AF 594二抗 | Invitrogen | -- | |
| DAPI | Invitrogen | -- | |
| FITC-鬼笔环肽 | Invitrogen | -- | |
| Prolong Gold抗淬灭封片剂 | Invitrogen | -- | |
| LSM 800激光共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | 小鼠品系、年龄、性别、饲养环境 阅读提示：Methods: Mice |
| 组织收集 | 刺激方法（局部卡巴胆碱）、RNA提取试剂盒 阅读提示：Methods: Tissue Collection |
| 细胞富集 | 胶原酶I浓度、消化时间、细胞滤网规格、离心条件 阅读提示：Methods: LG Immune and Epithelial Cell Enrichment |
| 小RNA测序 | 文库构建试剂盒、测序平台、读长、测序深度、比对工具 阅读提示：Methods: sRNAseq and Bioinformatics |
| RT-qPCR | 逆转录试剂盒、qPCR试剂盒、引物、内参、数据分析方法 阅读提示：Methods: RT-qPCR |
| 蛋白质验证 | 裂解液、抗体、稀释比例、孵育条件 阅读提示：Methods: Western Blotting, Immunofluorescence |