角膜基质干细胞来源的细胞外囊泡通过靶向Notch通路增强眼表上皮干细胞的干性

目的：角膜缘微环境支持角膜缘上皮干细胞（LESCs）的自我更新。角膜基质干细胞（CSSC）是该微环境中调节LESC表型的重要组分。然而，LESCs与CSSCs之间的细胞间通讯机制尚未阐明。方法：采用传统二维（2D）培养系统、直接三维（3D）共培养系统及间接3D共培养系统研究CSSCs对LESCs的旁分泌作用。通过向LESC培养基中分别添加GW4869和CSSC来源的细胞外囊泡（CSSC-EVs），揭示CSSC-EVs对LESCs的影响。比较不同培养方法下细胞的迁移率、细胞密度、分化状态及干性维持能力。对CSSC-EVs中的miRNA进行测序分析，并通过RT-qPCR和Western blotting验证其靶向的Notch通路。结果：与2D培养相比，直接和间接3D共培养系统均能显著提高LESCs的迁移率和干细胞标志物表达水平，且两种共培养方式获得的LESC表型特征相似。GW4869可抑制CSSCs对LESCs的调控作用，而在2D培养体系中添加CSSC-EVs能增加细胞密度和p63αbright细胞比例，表明CSSC-EVs在调控LESCs中起关键作用。此外，miRNA含量降低的EV-AlixKD部分丧失了调控功能。CSSC-EVs中富集的hsa-miR-663b、hsa-miR-16-5p和hsa-miR-1290等miRNA可靶向Notch通路。转染miR-663b的LESCs通过下调Notch通路表现出更高的p63表达。结论：CSSC-EVs通过miRNA靶向Notch信号通路，在促进LESC增殖和干性维持中发挥重要作用。这一发现深化了对角膜缘微环境的理解，并为LESC培养及角膜上皮疾病的治疗提供了潜在新策略。