细胞培养与处理
建立DEX和GIM处理的hTM细胞模型，以模拟糖皮质激素性青光眼环境。
将原代hTM细胞培养于塑料培养皿上，用Veh或100 nM DEX在1%FBS培养基中处理1、3、5、7天；同时将hTM细胞接种于VehM或GIM上，在1%FBS培养基中培养相同时间点，不添加额外药物。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
地塞米松和糖皮质激素诱导的基质时间性调节人小梁网细胞中的关键整合素、小窝蛋白、收缩性和硬度
Dexamethasone and Glucocorticoid-Induced Matrix Temporally Modulate Key Integrins, Caveolins, Contractility, and Stiffness in Human Trabecular Meshwork Cells
实验完整度
高包含体外细胞模型（hTM细胞）、细胞来源基质（CDMs）的制备与表征、免疫细胞化学、Western blot、透射电镜及原子力显微镜测量细胞硬度等多个独立实验层级，并进行了功能验证（收缩性相关蛋白）和机制验证（整合素/小窝蛋白/Rho GTPase通路）。
主要模型
原代人小梁网（hTM）细胞 细胞来源基质（VehM和GIM） 地塞米松处理hTM细胞模型
重点核对
hTM细胞供体年龄范围48-75岁，无眼部疾病史 DEX浓度为100 nM，处理时间1、3、5、7天 细胞培养在1%FBS培养基中 矩阵生成：hTM细胞用100 nM DEX或EtOH处理4周，用20 mM氢氧化铵脱细胞 蛋白表达分析使用Western blot，以β-Actin为内参，数据以均值±SEM表示，n=3-5 统计分析使用双因素方差分析（two-way ANOVA）和Holm-Sidak多重比较检验 原子力显微镜测量细胞弹性模量，使用PNP-TR悬臂，至少5条力曲线，10个随机细胞
摘要
目的：确定地塞米松（DEX）和糖皮质激素诱导的基质（GIM）对人小梁网（hTM）细胞中整合素/整合素黏着斑、小窝蛋白、细胞骨架相关蛋白和硬度的时效性影响。方法：将原代hTM细胞接种于塑料培养皿（TCP）上，在含1%血清的培养基中用载体（Veh）或100 nM DEX处理1、3、5和7天。同时，将hTM细胞也接种于载体对照基质（VehMs）和GIMs上，处理相同时间点；VehMs和GIMs由慢性培养的Veh-/DEX刺激的hTM细胞产生，并进行了生化表征。部分细胞在接种于TCP或VehMs/GIMs之前作为基线。测定hTM细胞的机械感受器、细胞骨架相关蛋白的蛋白表达和弹性模量。结果：与Veh相比，DEX在第3天至第7天时间性过表达αV、β3和β5整合素，并在第7天过表达整合素连接激酶。然而，DEX在第1天和第7天降低β1整合素，而在第7天以时间非依赖性方式增加Cavin1。此外，DEX在第7天和第5天分别时间性上调α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和RhoA；而时间性下调Cdc42在第3天和第7天。相反，GIM显示纤连蛋白额外结构域A和B亚型的免疫染色增加。与VehM相比，GIM在第3天至第7天、第3天和第7天、第5天分别时间性增加hTM细胞中的αV整合素、Cavin1和RhoA。此外，GIM在第3天和第7天过表达α-SMA，并以时间非依赖性方式从第1天到第7天使hTM细胞变硬。结论：我们的数据强调了关键的机械感受器、整合素黏着斑和肌动蛋白相关蛋白，它们可能时间性地维持DEX和/或GIM在hTM细胞中诱导的纤维化表型。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DEX和GIM是否以时间依赖性方式调节hTM细胞中整合素、小窝蛋白和细胞骨架相关蛋白的表达，并影响细胞收缩性和硬度？
- 核心机制
- DEX和GIM通过时间性调节整合素亚基（αV、β3、β5）、整合素连接激酶、Cavin1以及Rho GTPase（RhoA、Cdc42）和α-SMA的表达，促进hTM细胞的纤维化表型，表现为细胞收缩性增加和硬度升高。GIM的作用可能由ECM中的纤连蛋白ED-A/ED-B异构体驱动，而DEX的作用依赖于糖皮质激素受体。
- 主要证据
- Western blot分析显示DEX从第3天到第7天持续上调αV、β3、β5整合素和ILK，第7天上调Cavin1，第5天短暂上调RhoA，第3和第7天下调Cdc42，第7天上调α-SMA；GIM从第3到第7天上调αV整合素，第3和第7天上调Cavin1，第5天上调RhoA，第3和第7天上调α-SMA，并增加细胞弹性模量。免疫细胞化学显示GIM中纤连蛋白ED-A/ED-B染色增加，透射电镜显示细胞形成小窝。
- 研究意义
- 本研究首次在hTM细胞中同时评估DEX和GIM对多种机械感受器和细胞骨架蛋白的时间依赖性影响，提示这些分子可能是糖皮质激素性青光眼和原发性开角型青光眼的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
基质制备与表征
生成DEX诱导的细胞来源基质（GIM）和载体对照基质（VehM），并验证其脱细胞和ECM成分。
将hTM细胞培养至80-90%融合后，用100 nM DEX或EtOH处理4周，每隔一天换液；用20 mM氢氧化铵、0.05%Triton X-100去除细胞，获得VehM或GIM；用DNase I和RNase A处理，并通过免疫细胞化学检测纤连蛋白、胶原IV、纤连蛋白ED-A/ED-B，以及F-actin和DAPI确认细胞去除完全。
蛋白表达分析
检测DEX和GIM处理对hTM细胞中整合素、小窝蛋白和细胞骨架相关蛋白表达的影响。
在不同时间点裂解细胞，提取蛋白，通过Western blot检测指定蛋白的表达，以β-Actin为内参，并进行灰度分析。
细胞硬度测量
评估GIM对hTM细胞弹性模量的影响。
使用原子力显微镜（AFM）测量培养在VehM和GIM上1、3、5、7天的hTM细胞的弹性模量，每细胞至少5条力曲线，随机选择至少10个细胞。
小窝形态观察
验证hTM细胞在VehM和GIM上培养时是否形成小窝结构。
将在VehM或GIM上培养7天的hTM细胞固定、包埋，通过透射电子显微镜观察细胞膜上的小窝。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 乙醇 | -- | -- | |
| 基质制备 | 氢氧化铵 | -- | -- |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | -- | -- | |
| 核糖核酸酶A | -- | -- | |
| 免疫细胞化学 | 牛血清白蛋白 | -- | -- |
| 抗纤连蛋白抗体 | Abcam | ab6584 | |
| 抗纤连蛋白额外结构域A抗体 | Abcam | ab6328 | |
| 抗纤连蛋白额外结构域B抗体 | Abcam | ab154210 | |
| 抗IV型胶原抗体 | Abcam | ab6311 | |
| Alexa Fluor 488抗兔二抗 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Alexa Fluor 488抗小鼠二抗 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| CF594偶联鬼笔环肽 | Biotium | 00045 | |
| DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
| Fluoromount-G封片剂 | Southern Biotech | 0100-01 | |
| 激光扫描共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM 800 | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Thermo Scientific | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Fisher Scientific | -- | |
| 磷酸酶抑制剂 | Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白定量 | DC蛋白定量试剂盒 | Biorad | -- |
| Western blot | Laemmli缓冲液 | -- | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| ECL底物 | Life Technologies | -- | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Biorad | -- | |
| ImageJ | -- | -- | |
| 抗体 | FKBP5抗体 | Cell Signaling Technology | 12210 |
| αV整合素抗体 | Cell Signaling Technology | 4711 | |
| β1整合素抗体 | Cell Signaling Technology | 9699 | |
| β3整合素抗体 | Cell Signaling Technology | 13166 | |
| β5整合素抗体 | Cell Signaling Technology | 3629 | |
| 黏着斑激酶抗体 | Cell Signaling Technology | 3285 | |
| 磷酸化黏着斑激酶抗体 | Cell Signaling Technology | 8556 | |
| 整合素连接激酶抗体 | Cell Signaling Technology | 3856 | |
| 小窝蛋白1抗体 | Cell Signaling Technology | 3267 | |
| Cavin1抗体 | Cell Signaling Technology | 46379 | |
| Cdc42抗体 | Cell Signaling Technology | 2462 | |
| Rac1/2/3抗体 | Cell Signaling Technology | 2465 | |
| RhoA抗体 | Cell Signaling Technology | 2117 | |
| 波形蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 5741 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| α-平滑肌肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A5228 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Invitrogen | G-21234 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Invitrogen | G-21040 | |
| 电镜 | Embed 812树脂 | -- | -- |
| 原子力显微镜 | PNP-TR悬臂 | Nano and More | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞来源和代数；细胞密度；DEX浓度和处理时间；培养基血清浓度 阅读提示：Materials and Methods: Treating hTM Cells Cultured on Plastics With DEX Paralleled With Seeding Cells on VehM and GIM Without Further Treatment |
| 基质制备与表征 | DEX浓度和处理时间；脱细胞方法；DNase/RNase处理；抗体和浓度 阅读提示：Materials and Methods: Generating VehM and GIM from Cultured hTM Cells; Immunocytochemistry for Decellularized and Recellularized VehMs and GIMs |
| 蛋白表达分析 | 细胞裂解方法；蛋白定量方法；SDS-PAGE条件；抗体稀释和孵育时间；内参 阅读提示：Materials and Methods: Protein Extraction and Western Blot Analysis; Table |
| 细胞硬度测量 | AFM参数；力曲线获取数量；数据处理方法；泊松比和模型 阅读提示：Materials and Methods: Measuring Biomechanics of hTM Cells on VehMs and GIMs Via Atomic Force Microscopy |
| 统计方法 | 归一化方法；统计检验；显著性水平；重复数 阅读提示：Materials and Methods: Statistics |