基因表达分析
检测Reep6在睾丸发育过程中的表达模式
通过RT-PCR分析不同发育阶段（PND 3-35）小鼠睾丸中Reep6两种转录本的表达，并用Western blot验证蛋白水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
小鼠受体辅助蛋白6的敲除导致精子功能和形态缺陷
Knockout of mouse receptor accessory protein 6 leads to sperm function and morphology defects†
实验完整度
高包含基因表达分析、组织学、精子功能（IVF、CASA、CASAnova）、超微结构（SEM/TEM）和免疫荧光定位等多层级验证。
主要模型
Reep6敲除小鼠（C57BL/6J背景） 小鼠附睾尾精子 小鼠睾丸组织 小鼠卵母细胞（体外受精）
重点核对
Reep6 KO小鼠的构建和验证（Western blot确认蛋白缺失） 精子活力的CASA/CASAnova分析（HTF培养基，37°C，5% CO2） 体外受精实验（透明带完整和去除透明带的卵母细胞） 精子形态学分析（光学显微镜和SEM） REEP6在精子中的亚细胞定位（免疫荧光）
摘要
受体辅助蛋白6（REEP6）是REEP/Ypt相互作用蛋白家族的成员，我们最近发现该蛋白对小鼠和人类视网膜的正常内质网稳态和蛋白质运输至关重要。有趣的是，除了在我们的敲除（KO）小鼠模型中发现REEP6缺失重现了患有REEP6突变导致色素性视网膜炎（RP）的人类视网膜变性外，我们还发现雄性小鼠不育。在此，我们描述了由Reep6缺失引起的不育特征。两种Reep6 mRNA转录本在睾丸中均有表达；然而，异构体1在精子发生过程中过度表达。体外受精实验表明，Reep6 KO精子能够结合透明带，但只能使缺乏透明带的卵母细胞受精。尽管KO小鼠的精子发生看似正常，但附睾尾精子具有严重的运动缺陷和多种形态异常，包括尾部弯曲或缺失。免疫荧光染色显示，REEP6表达首先出现在IV期曲细精管的第15步精子细胞中，并且REEP6定位于成熟精子的连接段、中段和环。这些数据揭示了REEP6在精子运动和形态中的重要作用，并且是REEP蛋白在生殖过程中的首次报道功能。此外，这项工作确定了一个可能导致人类不育的新基因，并对携带REEP6突变的RP患者具有重要意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- REEP6在小鼠雄性生育力中的功能是什么？其缺失如何导致不育？
- 核心机制
- REEP6对于精子运动、形态和透明带穿透至关重要，其缺失导致严重的运动缺陷和形态异常，特别是尾部弯曲和缺失，但机制尚未完全阐明，可能涉及尾部结构和功能蛋白的定位异常。
- 主要证据
- Reep6 KO小鼠雄性不育，精子体外受精不能穿透透明带，而能受精去除透明带的卵母细胞；CASA/CASAnova显示精子运动力显著下降；形态学显示尾部弯曲和缺失；免疫荧光显示REEP6定位于连接段、中段和环。
- 研究意义
- REEP6是精子运动和形态的关键蛋白，其突变可能导致人类不育，对携带REEP6突变的RP患者具有重要意义，可能为男性不育的诊断和治疗提供新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
生育力评估
评估Reep6 KO雄性的生育能力
将KO雄性分别与野生型雌性进行交配，统计产仔数。
精子功能检测
鉴定Reep6 KO精子的功能缺陷
通过体内和体外受精实验评估精子受精能力，检测精子活力（CASA/CASAnova）、形态（光学显微镜、SEM）和顶体反应。
形态学与超微结构分析
观察Reep6 KO精子及睾丸的超微结构异常
使用PAS-苏木精染色观察睾丸和附睾组织学，SEM和TEM分析精子及精细胞超微结构。
蛋白定位与结构完整性评估
确定REEP6的亚细胞定位及线粒体和轴丝结构是否受影响
通过免疫荧光染色定位REEP6，使用MitoTracker和抗乙酰化α-tubulin染色评估线粒体和轴丝。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体 | 抗REEP6抗体 | -- | -- |
| Western blot | 抗GAPDH-HRP | ProteinTech | HRP-60004 |
| 免疫荧光 | 抗α-微管蛋白-AF488 | ThermoFisher | 322588 |
| 抗乙酰化α-微管蛋白 | Cell Signaling | 5335 | |
| 顶体染色 | 花生凝集素-FITC | Sigma-Aldrich | L7381 |
| 免疫荧光 | 大豆凝集素-FITC | Vector Labs | FL-1011 |
| 线粒体染色 | MitoTracker Red FM | Invitrogen | M7512 |
| 核染色 | DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
| 精子活力检测 | LIVE/DEAD精子活力试剂盒 | Invitrogen | L-7011 |
| Western blot | T-PER组织蛋白提取试剂 | ThermoFisher | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | ThermoFisher | -- | |
| TransBlot TURBO | BioRad | -- | |
| SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物 | ThermoFisher | -- | |
| RT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- | |
| qScript cDNA Supermix | Quanta Biosciences | -- | |
| GoTaq Green Master Mix | Promega | -- | |
| 精子活力分析 | CEROS II动物计算机辅助精子分析仪 | Hamilton Thorne | -- |
| 100 μm深度的计数玻片 | CellVision | -- | |
| CASAnova | -- | -- | |
| 顶体反应 | 钙离子载体A23187 | -- | -- |
| 免疫荧光 | MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen | -- |
| Immu-mount水溶性封片剂 | Thermo Fisher | -- | |
| 显微镜 | 蔡司LSM 880共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 蔡司AxioObserver Z.1 | Zeiss | -- | |
| 组织固定 | 布安氏固定液 | Sigma Aldrich | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | C57BL/6J背景的Reep6杂合和敲除小鼠 阅读提示：Materials and methods: Animals |
| 精子采集与培养 | 附睾尾精子释放条件，HTF培养基成分 阅读提示：Materials and methods: CASA and CASAnova mouse sperm motility analysis |
| 精子活力分析 | CASA参数设置（如帧率等），CASAnova分类标准 阅读提示：Materials and methods: CASA and CASAnova mouse sperm motility analysis |
| 体外受精 | 卵母细胞获取，透明带处理，精子浓度 阅读提示：Materials and methods: In vivo and in vitro fertilization analysis |
| 形态学分析 | 精子固定和SEM/TEM样品制备条件 阅读提示：Materials and methods: Scanning electron microscopy and transmission electron microscopy |
| 免疫荧光 | 抗体稀释比例，固定和封闭条件 阅读提示：Materials and methods: Immunofluorescent staining |