鉴定MIF相互作用蛋白
寻找与MIF相互作用并参与SpA病理的关键分子。
利用IID数据库分析MIF的蛋白-蛋白相互作用，在SpA相关组织、细胞和条件下筛选出HIF1A、SOD1、COX8A，并验证HIF1A在SpA中表达增加及与MIF的物理结合。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
HIF-1α与MIF在小鼠脊柱关节炎模型中增强中性粒细胞驱动的3型免疫和软骨生成
HIF-1α and MIF enhance neutrophil-driven type 3 immunity and chondrogenesis in a murine spondyloarthritis model
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内动物模型（curdlan-SKG和IL-23过表达小鼠）、患者样本分析、功能验证（基因敲除和药理抑制）及机制验证（STAT3通路）。
主要模型
curdlan-SKG小鼠模型 IL-23过表达SKG小鼠模型 SKG小鼠原代骨膜细胞（PCs） SpA患者滑液细胞及脊柱骨组织
重点核对
HIF1A抑制剂PX-478的剂量（5或10 mg/kg，口服，每周三次） curdlan注射剂量（3 mg/只，腹腔注射） 中性粒细胞培养条件（低氧2% O2，curdlan 10 μg/ml刺激18小时） MIF基因敲除SKG小鼠（Mif-/-） IL-23质粒过表达方法（HDD尾静脉注射5 μg/只）
摘要
脊柱关节炎（SpA）的标志是3型免疫驱动的炎症和新骨形成（NBF）。巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）被发现是SpA发病的关键驱动因素，通过放大3型免疫发挥作用，然而MIF相互作用分子和网络仍然不清楚。在此，我们确定了缺氧诱导因子-1α（HIF1A）是MIF的相互作用伙伴分子，驱动SpA病理，包括炎症和NBF。与各自对照组相比，SpA患者和葡聚糖注射的SKG（curdlan-SKG）小鼠的关节组织和滑液中HIF1A表达增加。在HIF1A稳定的低氧条件下，人和小鼠中性粒细胞表现出MIF和IL-23（一种上游3型免疫相关细胞因子）的表达显著增加。与MIF类似，IL-23的全身过表达在SKG小鼠中诱导SpA病理，而将HIF1A选择性抑制剂（PX-478）注射到curdlan-SKG小鼠中可预防或减轻SpA病理，表现为MIF和IL-23表达显著降低。此外，在IL-23过表达的SKG小鼠中，遗传缺失MIF或用PX-478抑制HIF1A并未诱导明显的关节炎或NBF，尽管存在银屑病样皮炎和睑缘炎。我们还发现，表达MIF和IL-23的中性粒细胞浸润curdlan-SKG小鼠NBF区域。这些中性粒细胞可能通过上调骨膜细胞和韧带细胞中的STAT3，在软骨内骨化过程中增加软骨生成和细胞增殖。总之，这些结果为MIF/HIF1A调控网络提供了支持证据，抑制HIF1A可能通过抑制3型免疫介导的炎症和NBF成为SpA的新型治疗方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MIF相互作用的分子及其在SpA发病机制中的作用是什么？
- 核心机制
- HIF1A与MIF相互增强表达，促进中性粒细胞分泌IL-23，激活3型免疫，并通过STAT3信号通路促进骨膜细胞和韧带细胞的软骨生成及增殖，导致NBF形成。
- 主要证据
- 在SpA患者和curdlan-SKG小鼠中检测到HIF1A和MIF表达增加；体外实验显示中性粒细胞在低氧条件下分泌MIF和IL-23增加；PX-478抑制HIF1A可减轻炎症和NBF；MIF敲除或HIF1A抑制在IL-23过表达小鼠中阻止关节炎和NBF，但皮肤病变仍存在。
- 研究意义
- 揭示了MIF/HIF1A调控网络在SpA中的关键作用，提出HIF1A是治疗SpA的新靶点，抑制HIF1A可能通过抑制3型免疫介导的炎症和NBF提供治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证HIF1A与MIF相互调控
确认MIF和HIF1A在中性粒细胞中是否相互促进表达。
体外培养SKG小鼠中性粒细胞，用curdlan刺激或低氧处理，检测HIF1A和MIF表达，并使用PX-478抑制HIF1A观察MIF变化。
评估HIF1A对IL-23表达的影响
探索HIF1A是否通过促进IL-23表达来驱动3型免疫。
检测低氧条件下中性粒细胞中IL-23 p19的表达和分泌，并使用PX-478或MIF敲除观察对IL-23的影响。
体内药理学抑制HIF1A
评估PX-478对curdlan-SKG小鼠SpA病理的预防和治疗效果。
在curdlan注射后不同时间点口服PX-478，评估临床评分、组织学、microCT和新骨形成标志物。
构建IL-23过表达小鼠模型
验证IL-23单独过表达是否足以诱导SpA病理。
通过水动力尾静脉注射IL-23质粒（PLM）至SKG小鼠，观察临床表型、组织学、microCT及免疫细胞变化。
评估MIF或HIF1A在IL-23诱导病理中的作用
确定在IL-23过表达条件下MIF和HIF1A对关节炎和NBF的必要性。
在IL-23过表达SKG小鼠中，通过基因敲除MIF或用PX-478抑制HIF1A，观察临床和组织学变化。
研究MIF和IL-23对软骨生成的影响
探讨MIF和IL-23是否促进骨膜细胞和韧带细胞的软骨生成。
从SKG小鼠胫骨分离骨膜细胞和胫距韧带细胞，用重组MIF或IL-23处理，检测软骨生成标志物（SOX9、COL2A1等）和信号通路。
验证STAT3在MIF/HIF1A诱导软骨生成中的作用
确认STAT3是否介导MIF和IL-23诱导的软骨生成。
在骨膜细胞中敲低STAT3，或用PX-478抑制HIF1A，检测SOX9表达；使用患者样本和动物模型观察p-STAT3表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | PX-478 | Selleck biochemistry | S76120 |
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Wisent Bioproducts | 080-150 | |
| 青霉素/链霉素 | Wisent Bioproducts | 450-200-EL | |
| 细胞处理 | 可得然胶 | -- | -- |
| 重组小鼠MIF | -- | -- | |
| 重组小鼠IL-23 | -- | -- | |
| IL-23 p19中和抗体 | R&D | AF1619 | |
| 转染 | STAT3 siRNA | Santa Cruz | sc-29494 |
| 对照siRNA | Qiagen | 1027280 | |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 流式分析 | 布雷菲德菌素A | BioLegend | 420601 |
| PMA/离子霉素 | BioLegend | 423302 | |
| 可固定活/死细胞染料 | Invitrogen | L10119 | |
| Fc受体阻断剂 | BioLegend | 101320 | |
| 染色缓冲液 | BioLegend | 420201 | |
| 胞内染色缓冲液 | BioLegend | 421002 | |
| LSR II或Canto II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| qPCR | QuantiTect逆转录PCR试剂盒 | Qiagen | 205311 |
| SYBR Green预混液 | Bio-Rad | 1725271 | |
| LightCycler 480实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | Sigma-Aldrich | R0278 |
| Tris缓冲盐水 | Bio-Basic | A0027 | |
| 脱脂牛奶 | BioShop | SKI400 | |
| 吐温-20 | BioShop | TWN510 | |
| 一抗 | -- | -- | |
| HRP标记二抗 | Sigma-Aldrich | -- | |
| SuperSignal Western blot增强剂 | Thermo Fisher Scientific | 46640 | |
| ChemiDoc成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫沉淀 | 免疫沉淀试剂盒 | Abcam | ab206996 |
| 细胞裂解缓冲液 | Cell Signaling | 9803S | |
| Protein A/G-Sepharose珠 | -- | -- | |
| 抗MIF抗体 | Thermo Fisher | 20415-1-AP | |
| 对照IgG | Abcam | ab37415 | |
| Protein G偶联Sepharose珠 | Abcam | 193259 | |
| ELISA | LEGEND MAX小鼠IL-23 ELISA试剂盒 | BioLegend | 433707 |
| LEGEND MAX小鼠IL-17A ELISA试剂盒 | BioLegend | 436207 | |
| LEGEND MAX小鼠MIF ELISA试剂盒 | BioLegend | 444107 | |
| LEGEND MAX人活性MIF ELISA试剂盒 | BioLegend | 438407 | |
| 组织学 | 10%中性缓冲福尔马林 | -- | -- |
| EDTA | BioShop | -- | |
| 番红O/固绿染色 | -- | -- | |
| OCT包埋剂 | -- | -- | |
| 蛋白酶K | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| IHC | Vectastain Elite ABC试剂盒 | Vector Laboratories | PK-6100 |
| DAB HRP底物试剂盒 | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| IF | DAPI | -- | -- |
| 抗荧光淬灭封片剂 | DAKO | -- | |
| EVOS FL成像系统 | Life Technologies | -- | |
| CYTATION5成像仪 | Bio Tek | -- | |
| microCT | SkyScan 1276 microCT | Bruker Corporation | -- |
| InstaRecon软件 | -- | -- | |
| CTvox软件 | Bruker Corporation | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| 细胞培养 | Hank's平衡盐溶液 | -- | -- |
| 动物实验 | 抗Ly6G单克隆抗体 | Bio X Cell | BP0075-1 |
| 抗κ IgG2 | Bio X Cell | BE0122 | |
| 同型IgG对照单克隆抗体 | Bio X Cell | BP0089 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | SKG小鼠品系、年龄、性别；curdlan剂量和给药途径；IL-23或MIF质粒剂量和给药方式；对照组设置 阅读提示：Materials and methods: Animal model, treatments, and clinical scoring |
| HIF1A抑制 | PX-478剂量、给药频率、给药时间点；小鼠周龄和体重 阅读提示：Materials and methods: Animal model, treatments, and clinical scoring; Figure legends 2 and 3 |
| 中性粒细胞培养 | 骨髓中性粒细胞分离方法；培养密度；刺激物（curdlan）浓度；处理时间；低氧条件（2% O2）和常氧条件（21% O2）；PX-478浓度 阅读提示：Materials and methods: Curdlan or MIF treatment of cells and tissues |
| 骨膜细胞培养 | 骨膜细胞分离方法；培养时间；重组MIF或IL-23浓度；处理时间；低氧条件；STAT3 siRNA转染浓度和时间 阅读提示：Materials and methods: Curdlan or MIF treatment of cells and tissues |
| 微CT扫描 | 扫描参数（扫描仪型号、分辨率）；麻醉方法；图像重建软件 阅读提示：Materials and methods: Microcomputed tomography (microCT) |
| 统计分析 | 每组样本量；统计检验方法；多重比较校正方法；正态性检验 阅读提示：Materials and methods: Statistical analysis |