ISG功能筛选
系统鉴定抑制HSV-1复制的干扰素刺激基因。
将288个ISG逐一转染至HEK293T细胞，感染表达荧光素酶的HSV-1（HSV-1-Luc），检测荧光素酶活性以评估病毒复制水平，并通过RT-PCR和空斑实验验证候选基因。
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通过抑制Bach1增强HSV-1介导的抗肿瘤免疫应答
Enhancing the HSV-1-mediated antitumor immune response by suppressing Bach1
实验完整度
高包含体外细胞筛选、敲低/敲除验证、分子机制（ChIP、报告基因）以及两种体内肿瘤模型（MCA205和B16）的功能和机制验证。
主要模型
HEK293T细胞 MEF细胞 MCA205纤维肉瘤细胞 B16黑色素瘤细胞 MCA205/B16小鼠皮下移植瘤模型
重点核对
BACH1敲低/敲除细胞系（shRNA和CRISPR-Cas9） HSV-1感染剂量（MOI 0.25或1） hemin处理浓度（20μM，体内50mg/kg） HSV-1瘤内注射剂量（50μL 5×10^7 pfu/mL） C57BL/6小鼠模型
摘要
背景：2015年，源自单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的talimogene laherparepvec（T-VEC）成为美国食品药品监督管理局批准的首个用于癌症治疗的溶瘤病毒。然而，其抗肿瘤应用仅限于黑色素瘤的局部治疗，且对HSV-1在癌细胞中复制的调控机制及相关抗肿瘤免疫缺乏了解。我们假设增强HSV-1在肿瘤细胞中的复制能力将增强该病毒的抗肿瘤效果。方法：我们通过功能筛选系统性地鉴定了HSV-1诱导的干扰素刺激基因，并阐明了BACH1抗HSV-1的机制。随后，我们检测了BACH1缺失对HSV-1诱导的免疫原性细胞死亡的影响。此外，我们在MCA205和B16小鼠肿瘤模型中研究了BACH1缺失对HSV-1抗肿瘤效果的影响。结果：我们鉴定了八个控制HSV-1复制的干扰素刺激基因（ISGs），其中BTB和CNC同源蛋白1（BACH1）通过抑制ICP4、ICP27和UL39的转录来抑制HSV-1复制。Bach1功能丧失不仅增加了HSV-1的增殖，还促进了HSV-1诱导的肿瘤细胞凋亡、HMGB1分泌和钙网蛋白暴露。更重要的是，氯高铁血红素（hemin）是一种已知可下调BACH1的FDA批准药物，显著增强了HSV-1介导的抗肿瘤活性，并增加了肿瘤部位的T淋巴细胞浸润。结论：我们的研究揭示了BACH1的一种新的抗病毒活性，并为提高溶瘤病毒HSV-1的临床效率提供了新策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BACH1是否通过何种机制抑制HSV-1复制，其缺失能否增强HSV-1的抗肿瘤免疫应答。
- 核心机制
- BACH1作为转录因子，不依赖MAFK，直接结合HSV-1病毒基因ICP4、ICP27和UL39的启动子并抑制其转录，从而抑制病毒复制。
- 主要证据
- 通过功能筛选鉴定BACH1为抗HSV-1的ISG；在HEK293T、MEF、MCA205和B16细胞中敲低/敲除Bach1增加HSV-1复制；ChIP和报告基因实验证明BACH1结合并抑制病毒基因启动子；在MCA205和B16小鼠模型中，Bach1缺失或hemin处理增强HSV-1的抗肿瘤活性、T淋巴细胞浸润和免疫原性细胞死亡。
- 研究意义
- 研究首次揭示BACH1作为新型抗HSV-1 ISG的功能，并提出使用FDA批准的药物hemin联合T-VEC的潜在组合疗法以提高溶瘤病毒治疗效率。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
BACH1功能验证
确认BACH1对HSV-1复制的影响及其在不同细胞中的一致性。
使用shRNA敲低或CRISPR-Cas9敲除BACH1，感染HSV-1或T-VEC，通过qRT-PCR检测病毒基因组拷贝数。
hemin处理实验
验证通过药物降解BACH1是否能类似遗传学操作增强HSV-1复制。
用20μM hemin处理细胞，通过Western blot检测BACH1蛋白水平，并通过qRT-PCR检测HSV-1基因组拷贝数。
机制研究：BACH1对病毒基因转录的调控
阐明BACH1抑制HSV-1复制的分子机制。
通过序列分析寻找BACH1结合位点，用qRT-PCR检测病毒基因表达，ChIP-PCR验证BACH1与启动子的结合，报告基因实验验证对转录的抑制作用。
体外功能验证：细胞死亡和抗原呈递
评估Bach1缺失对HSV-1诱导的免疫原性细胞死亡和抗原呈递的影响。
比较Bach1+/+和Bach1−/− MCA205细胞在HSV-1感染后的凋亡、ATP释放、钙网蛋白暴露、HMGB1分泌，以及通过OT-I模型检测抗原呈递。
体内实验：Bach1缺失对HSV-1抗肿瘤效果的影响
在免疫活性小鼠模型中验证Bach1缺失对HSV-1抗肿瘤活性的增强作用。
将Bach1+/+和Bach1−/− MCA205或B16细胞皮下接种C57BL/6小鼠，成瘤后瘤内注射HSV-1，监测肿瘤生长、病毒复制和肿瘤浸润T淋巴细胞。
体内实验：hemin联合HSV-1的抗肿瘤效果
评估FDA批准的药物hemin联合HSV-1能否增强抗肿瘤免疫应答。
在MCA205或B16皮下移植瘤模型中，每日腹腔注射hemin（50mg/kg），并联合瘤内注射HSV-1，监测肿瘤生长、病毒复制及T细胞浸润。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
筛选平台
DNA结合分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | 氯高铁血红素 | MedChemExpress | HY-19424 |
| 细胞培养 | 多聚-L-赖氨酸 | Sigma | P4707 |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 |
| 基因编辑 | pMD2.G质粒 | Addgene | 12259 |
| psPAX2质粒 | Addgene | 12260 | |
| LentiCRISPR v2载体 | Addgene | 52961 | |
| 免疫印迹 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 04693132001 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0011 | |
| 抗BACH1抗体 | Abcam | ab124919 | |
| 抗MAFK抗体 | Immunoway | YN2091 | |
| 抗肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 8457S | |
| 抗微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2146S | |
| 抗兔IgG二抗 | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| ECL化学发光试剂 | Tanon | 180-5001 | |
| ChemiDoc XRS+成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞功能检测 | DAPI染色液 | BBI Life Sciences | 564907 |
| Annexin V-PE凋亡检测试剂 | BD Biosciences | 556421 | |
| 抗钙网蛋白抗体 | Abcam | ab196159 | |
| ENLITEN ATP检测系统 | Promega | FF2000 | |
| HMGB1 ELISA试剂盒 | IBL | ST51011 | |
| 抗原呈递实验 | 抗IFN-γ捕获抗体 | BD Biosciences | 551881 |
| CTL ImmunoSpot S6分析仪 | CTL | -- | |
| RNA提取与qPCR | NucleoZol RNA提取试剂 | MN | 740404.200 |
| 一步法PrimeScript RT-PCR试剂盒 | TaKaRa | 6110A | |
| LightCycler 96实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| SYBR Green qPCR预混液 | Bimake.cn | B21202 | |
| 报告基因实验 | pGL4荧光素酶报告载体 | Addgene | E6721 |
| 海肾荧光素酶质粒 | Promega | -- | |
| Dual-Glo双荧光素酶检测试剂盒 | Promega | -- | |
| 染色质免疫沉淀 | 抗BACH1抗体 | Abcam | ab245548 |
| 兔IgG | Cell Signaling Technology | 2729S | |
| 动物实验 | 脱氧核糖核酸酶I | Calbiochem | -- |
| Liberase TL消化酶 | Roche | -- | |
| 流式细胞术 | Vivid Yellow活性染料 | Invitrogen | L34959 |
| 抗CD8抗体 | BioLegend | 100708 | |
| 抗CD45.2抗体 | BioLegend | 109814 | |
| Attune NxT流式细胞仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫荧光染色 | 抗CD8a抗体 | Abcam | ab217344 |
| Alexa488标记山羊抗兔IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Hoechst 33258染色液 | Thermo Fisher Scientific | H3569 | |
| 共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| 统计分析 | Prism 5统计分析软件 | GraphPad | -- |
| Excel 2007 | Microsoft | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基类型（DMEM/RPMI1640）、血清浓度（10% FBS）、抗生素（100 U/mL青霉素-链霉素）、培养环境（37°C, 5% CO2） 阅读提示：Materials and methods: Cell lines, virus, and reagents |
| 病毒扩增和滴度 | HSV-1毒株（strain F）、Vero细胞扩增、滴度测定方法 阅读提示：Materials and methods: Cell lines, virus, and reagents |
| 功能筛选 | HEK293T细胞铺板密度、poly-L-lysine包被、转染试剂和条件（Lipo3000, 36h）、HSV-1-Luc感染MOI（0.25）和时间（1h）、裂解时间（12hpi）、荧光素酶检测试剂盒 阅读提示：Materials and methods: HSV-1 screening; Figure 1 legend |
| 敲低/敲除细胞系构建 | shRNA/sgRNA序列、载体（LV2N, LentiCRISPR v2）、包装质粒（pMD2.G, psPAX2）、嘌呤霉素筛选浓度和时间、单克隆分选方法 阅读提示：Materials and methods: Construction of stable cell lines |
| 病毒感染和复制检测 | 细胞类型、病毒MOI（0.25或1）、感染时间（24h）、基因组DNA提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit）、qPCR检测 阅读提示：Materials and methods: Detection of the HSV-1 genome copy number; Figure 2 legend |
| 药物处理（hemin） | hemin浓度（20μM）、溶剂（20mM NaOH, pH 7.5）、过滤（0.22μm）、处理时间 阅读提示：Materials and methods: Cell lines, virus, and reagents; Figure 2E–G |
| 分子机制验证 | ChIP-qPCR的条件（抗体、IgG对照）、报告基因构建和检测方法（Dual-Glo） 阅读提示：Materials and methods: ChIP-PCR assay; Promoter reporter analysis; Figure 3 legend |
| 细胞死亡和免疫原性检测 | MOI（1）、感染时间（24/36/48h）、凋亡染色（Annexin V/DAPI）、钙网蛋白检测（抗CRT抗体）、ATP检测（ENLITEN系统）、HMGB1 ELISA 阅读提示：Materials and methods: Cell death, CRT exposure, ATP release, and HMGB1 secretion; Figure 5 legend |
| 体内肿瘤模型 | 小鼠品系（C57BL/6雌性，6-8周龄）、细胞接种数量、肿瘤大小（~25mm²）时开始治疗、HSV-1剂量（50μL 5×10^7 pfu/mL）、注射途径（瘤内）、频次（隔日一次，共4次）、hemin剂量（50mg/kg, 每日腹腔注射） 阅读提示：Materials and methods: Tumor model; Figure 4 and 6 legends |
| 免疫细胞分析 | 肿瘤单细胞消化方法、抗体染色（CD8, CD45.2, vivid yellow）、流式细胞仪（Attune NxT）、免疫荧光染色（CD8a, Hoechst）、ELISpot（IFN-γ） 阅读提示：Materials and methods: Immune cell isolation and flow cytometry analysis; Immunofluorescence staining; Enzyme-linked immunospot assay; Figure 4D–I and 6F–K |