IL-21分泌型沙门氏菌的构建与体外表征
构建能够分泌IL-21的工程菌株并验证其分泌能力
将FlgM-mIL-21融合蛋白克隆至pBAD18质粒，并敲除沙门氏菌的asd和rcsB基因，构建菌株#1237。通过Western blot和ELISA检测IL-21的表达和分泌，并评估生长曲线和运动性。
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分泌白细胞介素-21的减毒沙门氏菌激活T细胞并诱导抗肿瘤效应
Attenuated Salmonella secreting interleukin-21 activates T-cells and induces anti-tumor effects
实验完整度
高包含菌株构建与体外表征（Western blot、ELISA）、CT26荷瘤小鼠模型体内疗效与免疫分析（流式、IF）、联合抗PD-L1治疗及生物分布与安全性评估。
主要模型
CT26结肠癌细胞皮下移植的BALB/c小鼠模型 分泌IL-21的减毒沙门氏菌菌株（flgM-mIL-21-flhDC-pBAD18-asd+/#1237）
重点核对
菌株构建：aroA、aroD、asd、rcsB基因缺失的沙门氏菌SL1344突变株。 IL-21分泌诱导：0.2% L-阿拉伯糖诱导，腹腔注射给予80 mg/只/天，从感染后第3天开始。 肿瘤模型：CT26细胞（5×10^5）皮下注射于BALB/c小鼠右胁，肿瘤体积约100 mm3时开始治疗。 给药：沙门氏菌2×10^7 CFU静脉注射；抗PD-L1抗体200 μg/只腹腔注射，第0、3、6、9天。 体内分布与安全性：IVIS成像、菌落计数、血清生化指标（ALT、AST等）检测。
摘要
肿瘤微环境以免疫抑制状态为特征。尽管PD-1/PD-L1阻断疗法能激活针对肿瘤的免疫系统，但其长期疗效有限，促使人们开发与靶向治疗联合的方案以改善癌症治疗结局。最近的进展重新激发了人们对使用减毒沙门氏菌作为癌症治疗药物的兴趣，这些细菌靶向肿瘤、诱导免疫反应并促进肿瘤细胞死亡，尽管完全抑制肿瘤仍然具有挑战性。我们旨在通过沙门氏菌介导的白细胞介素-21（IL-21）分泌来激活肿瘤微环境中受抑制的免疫系统，从而诱导抗肿瘤效应。我们利用沙门氏菌的肿瘤靶向能力及其鞭毛三型分泌系统（FT3SS），通过鞭毛系统诱导IL-21分泌至肿瘤微环境，并评估局部免疫反应。我们还评估了在小鼠模型中联合沙门氏菌介导的IL-21递送和抗PD-L1治疗的疗效。IL-21分泌促进了CD4+和CD8+ T细胞的募集，并增强了细胞毒性相关分子的表达。接受抗PD-L1抗体联合治疗的荷瘤小鼠表现出更高的生存率和更强的肿瘤生长抑制。本研究证明了沙门氏菌的肿瘤靶向能力和体内安全性，突显其作为强大癌症治疗平台的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 通过沙门氏菌介导IL-21分泌到肿瘤微环境，能否激活免疫抑制状态下的抗肿瘤免疫反应，并增强抗PD-L1疗法的疗效？
- 核心机制
- IL-21分泌促进CD4+和CD8+ T细胞募集，增强CD8+ T细胞表达IFN-γ、穿孔素和颗粒酶B等细胞毒性分子，从而诱导肿瘤细胞凋亡和肿瘤微环境重塑。
- 主要证据
- 体外实验中，Western blot和ELISA确认IL-21分泌；体内实验中，CT26荷瘤小鼠模型显示IL-21分泌组肿瘤生长减缓、生存率提高，TUNEL阳性增加，Ki-67表达降低，并促进T细胞浸润和细胞毒性分子表达。
- 研究意义
- 该研究展示了工程化沙门氏菌作为安全有效的癌症治疗平台的潜力，为联合免疫治疗策略提供了基础，并为结直肠癌等实体瘤的治疗提供了新方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CT26荷瘤小鼠模型中IL-21分泌型沙门氏菌的抗肿瘤疗效评估
评估IL-21分泌型沙门氏菌在体内的抗肿瘤效果
向BALB/c小鼠皮下注射CT26细胞建立肿瘤模型，当肿瘤体积达到100-150 mm3时，静脉注射沙门氏菌，并通过腹腔注射L-阿拉伯糖诱导IL-21分泌。监测肿瘤体积、体重和生存率，并通过TUNEL和Ki-67染色分析肿瘤细胞凋亡和增殖。
肿瘤免疫微环境分析
验证IL-21分泌对T细胞浸润和细胞毒性活性的影响
在体内实验第7天收集肿瘤，通过流式细胞术和免疫荧光染色分析CD4+和CD8+ T细胞浸润，并检测CD8+ T细胞中颗粒酶B、穿孔素和IFN-γ的表达。同时用ELISA测量肿瘤组织中的IL-21浓度。
联合抗PD-L1疗法的抗肿瘤效果评估
检验IL-21分泌型沙门氏菌与抗PD-L1抗体联合治疗是否增强抗肿瘤效果
在CT26荷瘤小鼠中，静脉注射沙门氏菌并腹腔注射抗PD-L1抗体（200 μg/只，第0、3、6、9天），同时给予L-阿拉伯糖诱导IL-21分泌。监测肿瘤体积、生存率，并分析肿瘤组织的凋亡和增殖指标。
体内生物分布和安全性评估
评估沙门氏菌在体内的肿瘤靶向性和安全性
静脉注射表达荧光素酶的沙门氏菌（#2487），通过IVIS成像观察细菌在肿瘤和主要器官的分布。在感染后第1、7、14天测定细菌载量，并检测血清中ALT、AST、BUN、CREA水平和脾脏大小及组织病理学变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | LB肉汤 | -- | -- |
| Western blot | 抗His抗体 | SouthernBiotech | SB194b |
| 抗小鼠IL-21抗体 | R&D Systems | MAB594 | |
| HRP标记的抗小鼠IgG | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| HRP标记的抗大鼠IgG | Abcam | AB97057 | |
| ELISA | 小鼠IL-21 ELISA试剂盒 | Proteintech | KE10012 |
| 限制性内切酶消化 | NheI限制性内切酶 | Takara Bio | 1241A |
| SacI限制性内切酶 | Takara Bio | 1078A | |
| SalI限制性内切酶 | Takara Bio | 1080A | |
| ClaI限制性内切酶 | Takara Bio | 1034A | |
| 动物实验 | 抗PD-L1抗体 | Bio X cell | -- |
| 流式细胞术 | 抗CD3-PE-eF610抗体 | eBioscience | 61-0031-82 |
| 抗CD4-PerCP抗体 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| 抗CD8-AF700抗体 | eBioscience | 56-0081-82 | |
| 抗FVD-APC-Cy7抗体 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 免疫组织化学 | TUNEL检测试剂盒-HRP-DAB | Abcam | AB206386 |
| 抗Ki-67抗体 | Cell Signaling Technology | 12202 | |
| DAB检测系统 | Dako | K3468 | |
| 免疫荧光 | 抗CD4抗体 | Abcam | 183685 |
| 抗CD8α抗体 | Abcam | AB22378 | |
| 抗IFN-γ抗体 | Abcam | 133566 | |
| 抗颗粒酶B抗体 | Cell Signaling Technology | 17215S | |
| 抗穿孔素抗体 | Cell Signaling Technology | 44865S | |
| 抗PD-L1抗体 | Abcam | AB213480 | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| 体内成像 | IVIS Spectrum小动物活体成像系统 | -- | -- |
| 细胞培养 | CT26细胞 | -- | -- |
| 细菌培养 | pGEN-luxCDABE质粒 | Addgene | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 菌株构建与培养 | Salmonella菌株基因型（aroA、aroD、asd、rcsB缺失），质粒构建细节（flgM-mIL-21融合），L-阿拉伯糖诱导浓度（0.2%），培养条件（37°C，250 rpm，OD600至0.2时诱导）。 阅读提示：Methods 2.1-2.5 |
| 动物模型建立 | BALB/c小鼠品系、性别、周龄、体重；CT26细胞接种数量和部位；肿瘤体积达到100-150 mm3的处理时机。 阅读提示：Methods 2.6 |
| 治疗给药方案 | 沙门氏菌菌株、剂量（2×10^7 CFU）、给药途径（静脉注射）；L-阿拉伯糖剂量（80 mg/只）、给药途径（腹腔注射）、给药时机（感染后第3天起每日）；抗PD-L1抗体剂量（200 μg/只）、给药时间（第0、3、6、9天）。 阅读提示：Methods 2.6 |
| 免疫分析 | 肿瘤组织采集时间点（第7天）；流式细胞术抗体组合及其浓度；免疫荧光抗体及其浓度；ELISA检测IL-21的方法。 阅读提示：Methods 2.7, 2.8 |
| 体内分布和安全性评估 | 注射菌株（#2487），成像时间点；细菌载量测定时间点（第1、7、14天）；血清生化指标检测时间点。 阅读提示：Methods 2.9-2.11 |
| 数据分析 | 统计方法（t检验或Mann-Whitney U检验），显著性水平（P<0.05），数据展示（平均值±SEM）。 阅读提示：Methods 2.12 |