不同仿生支架膀胱扩大术的比较研究:静电纺纳米纤维支架与含脂肪干细胞的细胞外基质支架

Comparative study of bladder augmentation using different biomimetic scaffolds: electrospun nanofiber vs. extracellular matrix scaffold with adipose-derived stem cells

作者信息Xuesheng Wang, Fan Zhang, Zhonghan Zhou, Qiang Fu, Limin Liao
PMID40788005
发布时间2025-12-01
DOI10.1097/JS9.0000000000003152

实验完整度

研究涵盖体外细胞实验(细胞粘附、增殖、表型)、体内皮下植入组织相容性实验以及兔膀胱扩大模型的功能和组织学评价,包含多层级验证。

主要模型

兔膀胱扩大模型 兔脂肪间充质干细胞(ASCs) 兔膀胱上皮细胞

重点核对

ASCs接种密度:0.15×10^6 cells/mL 体内实验分组及样本量:无ASC组(SIS、PLLA、PLLA/Gelatin各n=10,6周和12周各5只);ASC组(ASCs-SIS、ASCs-PLLA、ASCs-PLLA/Gelatin各n=5) 膀胱缺损大小:3 cm × 3 cm 观察时间点:6周和12周 统计方法:Student's t-test 或 ANOVA,P<0.05

摘要

背景:采用胃肠道段进行膀胱扩大术是神经源性膀胱广泛使用的外科手术,但存在许多副作用的风险。然而,目前尚无关于哪些生物材料适用于膀胱扩大和重建的系统性研究。本研究旨在比较小肠黏膜下层(SIS)、聚左旋乳酸(PLLA)纳米纤维支架和PLLA/明胶复合纳米纤维支架作为组织工程膀胱扩大和重建中潜在膀胱壁替代材料的安全性和适用性。研究结果为临床应用中材料的选择提供了科学依据。方法:观察了包括SIS、PLLA纳米纤维支架和PLLA/明胶在内的支架的微观结构、细胞相容性、细胞粘附和组织相容性。此外,使用有或无脂肪干细胞(ASCs)植入的支架构建了膀胱扩大兔模型。通过膀胱造影和尿动力学检查评估重建膀胱的形态和功能。采用组织学和免疫荧光评估重建膀胱的再生状况。结果:与SIS和PLLA/明胶支架相比,PLLA支架具有合适的力学性能、孔径和孔隙率,有利于缝合、维持膀胱形态并促进接种的ASCs的粘附和增殖。所有动物在实验中均存活,无并发症,膀胱造影和尿动力学检查证实了植入部位的结构完整性。组织学和免疫组化分析表明,三种支架均能在6周和12周时再生膀胱壁结构。使用ASCs-PLLA支架重建的膀胱显示出优越的结构和功能特性,且ASCs-PLLA组与对照组再生的尿路上皮、平滑肌或血管无显著差异。结论:ASCs-PLLA支架——由具有良好生物学特性的PLLA和促进再生的ASCs组成——是膀胱扩大和重建的理想支架的有前景的候选材料。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
不同生物材料(SIS、PLLA、PLLA/Gelatin)在组织工程膀胱扩大和重建中的安全性和适用性如何?
核心机制
ASCs-PLLA支架促进膀胱再生的机制可能包括:支架的合适孔径和孔隙率支持细胞粘附增殖;ASCs在低氧条件下分泌VEGF、HGF、IL-10等细胞因子促进组织再生和免疫调节;再生组织形成类似天然膀胱的结构。
主要证据
体外实验显示PLLA支架利于ASCs粘附增殖;体内兔膀胱扩大模型显示ASCs-PLLA组具有更好的膀胱容量和顺应性,组织学显示上皮和肌肉再生与天然组织相似。
研究意义
ASCs-PLLA支架有望成为临床膀胱扩大和重建的理想支架,为材料选择提供科学依据,并有助于原位三维生物打印膀胱组织。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

支架理化性能表征

评估支架的微观结构和物理性能。

通过SEM观察支架的表面形貌和孔隙结构。

2

细胞培养与支架接种

确定最佳细胞接种密度,评估支架的细胞相容性。

将兔ASCs以不同密度接种于支架培养,通过CCK-8法检测细胞粘附和增殖。

3

细胞粘附与增殖检测

评价支架对细胞粘附和增殖的影响。

将0.15×10^6 cells/mL ASCs接种于包裹或未包裹FBN的支架,通过CCK-8检测细胞粘附率及连续培养至14天的增殖。

4

细胞表型检测

评估支架培养14天后ASCs表型维持。

通过流式细胞术检测CD44-PE、CD90-PB450、CD105-Violet605的表达。

5

细胞形态观察

观察ASCs在支架上的形态和分布。

通过SEM和荧光显微镜观察细胞骨架和核,用DiI标记细胞。

6

细胞因子分泌检测

评估低氧条件下ASCs分泌细胞因子的水平。

用ELISA检测缺氧预处理的ASCs培养上清中VEGF、HGF、IL-10的浓度。

7

细胞迁移实验

评估ASCs对膀胱上皮细胞迁移的影响。

通过划痕实验,将ASCs培养基上清加入膀胱上皮细胞,观察迁移。

8

体内组织相容性评估

评估植入物在体内的组织相容性和降解情况。

将无细胞和有细胞的支架皮下植入兔子背部,6周后进行组织学评估。

9

兔膀胱扩大模型构建

评估不同支架在膀胱扩大模型中的效果。

对兔进行膀胱部分切除,植入支架,随后进行膀胱造影和尿动力学检查。

10

膀胱造影与尿动力学检查

评估重建膀胱的形态和功能。

在术后6周和12周进行膀胱造影和尿动力学检查,测定膀胱容量、顺应性。

11

组织学与免疫荧光评估

评估重建膀胱的再生情况。

采集膀胱组织,进行H&E、Masson染色和免疫荧光检测。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
小肠黏膜下层Cook Biotech--
PLLA纳米纤维支架Medprin Biotech GmbH--
PLLA/明胶纳米纤维支架Medprin Biotech GmbH--
兔脂肪间充质干细胞Procell Life Science & Technology Co. Ltd.--
兔脂肪间充质干细胞培养基Cyagen Biosciences--
胎牛血清Gibco--
兔膀胱上皮细胞Procell Life Science & Technology Co. Ltd.--
F12K培养基Servicebio--
磷酸盐缓冲液----
纤连蛋白Sciencell--
细胞计数试剂盒-8Yeasen--
酶标仪Thermo Fisher--
CD44-PE抗体Biolegend--
CD90-PB450抗体Biolegend--
CD105-Violet605抗体Biolegend--
CytoFLEX流式细胞仪Beckman Coulter--
异硫氰酸荧光素-鬼笔环肽Servicebio--
4',6-二脒基-2-苯基吲哚Servicebio--
CM-DiI细胞膜荧光探针Servicebio--
IVIS Lumina II活体成像系统----
VEGF ELISA试剂盒CLOUD-CLONE CORP--
HGF ELISA试剂盒CLOUD-CLONE CORP--
IL-10 ELISA试剂盒CLOUD-CLONE CORP--
低氧培养箱Thermo Scientific--
倒置相差显微镜----
扫描电子显微镜(Gemini300)Zeiss--
青霉素Harbin Pharmaceutical Group Holding Co., Ltd.--
碘帕醇Aladdin--
尿动力学系统(MP 150)Biopac--
Masson三色染色----
广谱细胞角蛋白抗体(AE1/AE3)Abcamab9377
α-平滑肌肌动蛋白抗体Proteintech14395-1-AP
CD31抗体Abcamab199012
Image-Pro Plus 6.0Media Cybernetics--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养
ASCs培养条件:培养基(Cyagen培养基含10% FBS)、传代代数(P3-P4)、培养环境(37°C, 5% CO2)、细胞接种密度(0.15×10^6 cells/mL)
阅读提示:Methods: Cell cultures
支架处理
支架浸泡条件(PBS, 37°C, 24 h)、FBN涂层浓度(1 μg/cm^2)
阅读提示:Methods: Scaffold treatment
动物模型
动物品系、性别、体重(新西兰兔,雄性,2.0±0.3 kg)、分组及样本量(sham n=5, 实验组 n=10或5)、麻醉剂量(α-chloralose 80 mg/kg)、膀胱缺损大小(3 cm × 3 cm)、支架尺寸(3 cm × 3 cm)、细胞悬液体积和密度(2 ml, 0.15×10^6 cells/mL)
阅读提示:Methods: Bladder augmentation model
膀胱功能评估
造影剂种类及浓度(碘帕醇0.3 g/mL)、灌注速率(6 mL/min)、尿动力学系统(MP 150)
阅读提示:Methods: Cystography and urodynamic examination
组织学评估
固定液(10%福尔马林)、切片厚度(3-5 μm)、染色方法(H/E, Masson)、免疫荧光抗体及稀释度(AE1/AE3, α-SMA, CD31)、定量软件(Image-Pro Plus 6.0)
阅读提示:Methods: Histologic and immunofluorescence (IF) assessment