临床样本中circCCDC719-13的表达分析
检测前列腺癌组织和癌旁组织中TAMs以及原发灶和转移灶中巨噬细胞内circCCDC719-13的表达差异。
收集32例前列腺癌患者的癌组织和癌旁组织，分离TAMs，通过RT-qPCR检测circCCDC719-13表达，并比较原发灶和骨转移灶中巨噬细胞的表达。
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circCCDC719-13通过抑制HSP90调控巨噬细胞可塑性从而抑制前列腺癌进展和转移：一项转化研究
Regulation of macrophage plasticity by circCCDC7 19-13 through HSP90 inhibition suppresses prostate cancer progression and metastasis: a translational study
实验完整度
高文献包含临床样本表达分析、体外细胞功能实验（极化、迁移、侵袭）、机制验证（Co-IP、质谱、泛素化）以及体内淋巴结转移模型等多个独立证据层级，并明确进行了功能验证和机制验证。
主要模型
RAW264.7巨噬细胞 THP-1巨噬细胞 原代巨噬细胞(PMs)与PC3M共培养的TAM模型 BALB/c裸鼠腘窝淋巴结转移模型
重点核对
TAMs与PMs的分离方法（CD14磁珠分选）及样本来源 circCCDC719-13过表达慢病毒转染TAMs的MOI（50）及筛选条件（嘌呤霉素5 μg/mL，7天） M1/M2极化诱导条件（IFN-γ 20 ng/mL + LPS 500 ng/mL；IL-4 20 ng/mL + IL-13 20 ng/mL，处理48小时） 体外共培养实验的细胞比例和时长（PMs与PC3M共培养2天；Transwell侵袭实验共培养36小时） 体内实验中TAMs与PC3M细胞注射比例（4:1）及观察时间（24天）
摘要
背景：巨噬细胞通过分化为功能相反的M1或M2表型在肿瘤发展中发挥关键作用。M2向M1巨噬细胞的转化在癌症治疗中具有重要意义。非编码RNA，如circRNA和lncRNA，已被证明可通过特定途径调节巨噬细胞极化。然而，这一转化过程的分子机制仍不完全清楚。方法：在本研究中，我们探讨了circCCDC719-13在前列腺癌（PCA）中调节巨噬细胞极化的作用。我们检测了PCA中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和M2巨噬细胞中circCCDC719-13的表达水平。我们使用体外实验研究circCCDC719-13过表达慢病毒转染对M2极化和M2细胞因子表达水平的影响。我们还评估了TAM促进PCA细胞恶性行为的能力。此外，我们探索了circCCDC719-13的下游靶点及其在巨噬细胞极化中的作用。结果：我们发现circCCDC719-13在PCA的TAMs和M2巨噬细胞中显著降低。circCCDC719-13的过表达抑制了M2极化并下调了M2细胞因子的表达水平。circCCDC719-13的过表达也降低了TAM促进PCA细胞恶性行为的能力。我们的研究表明HSP90是circCCDC719-13的下游靶点，其可通过抑制铁死亡来调节巨噬细胞极化。HSP90的过表达恢复了circCCDC719-13过表达巨噬细胞的表型。circCCDC719-13过表达的TAMs抑制了PC3M细胞的生长和转移。结论：我们的研究结果表明circCCDC719-13可能通过诱导铁死亡和靶向HSP90来改变巨噬细胞极化，从而降低M2表型TAM的比例并抑制PCA的进展和转移。本研究结果为阐明巨噬细胞极化的分子机制提供了新的见解，并为PCA的靶向治疗提供了参考价值。关键词：铁死亡，前列腺癌，肿瘤相关巨噬细胞，肿瘤微环境
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circCCDC719-13是否以及如何通过调控肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的可塑性来影响前列腺癌的进展和转移？
- 核心机制
- circCCDC719-13通过靶向并促进HSP90的泛素化降解，诱导TAMs发生铁死亡，从而促进M2向M1极化，降低M2型TAMs比例，进而抑制前列腺癌细胞的EMT、侵袭和转移。
- 主要证据
- 体内外实验表明，circCCDC719-13过表达可诱导TAMs铁死亡（增加ROS、Fe2+、脂质过氧化，降低GSH），上调M1标志物CD86，下调M2标志物CD163，减少M2细胞因子分泌，并抑制PC3M细胞侵袭、迁移和体内转移；Co-IP和质谱证实HSP90为直接结合靶点，HSP90过表达可逆转这些效应。
- 研究意义
- 揭示了circCCDC719-13通过靶向HSP90调控巨噬细胞极化的新机制，为前列腺癌的靶向治疗提供了潜在靶点，具有临床转化价值。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外诱导巨噬细胞极化并检测circCCDC719-13表达
验证circCCDC719-13在M1和M2巨噬细胞中的表达变化。
使用LPS/IFN-γ诱导M0巨噬细胞向M1极化，使用IL-4/IL-13诱导向M2极化，通过RT-qPCR检测circCCDC719-13表达。
circCCDC719-13对TAMs极化和细胞因子分泌的影响
评估circCCDC719-13过表达对TAMs表型及细胞因子分泌的影响。
用circCCDC719-13过表达慢病毒转染TAMs，通过流式细胞术和免疫荧光检测CD86/CD163表达，通过RT-qPCR、Western blot和ELISA检测M1/M2细胞因子水平。
circCCDC719-13对TAMs促肿瘤功能的影响
验证circCCDC719-13过表达的TAMs对前列腺癌细胞侵袭、迁移和EMT的影响。
将过表达circCCDC719-13的TAMs与PC3M细胞共培养，进行Transwell侵袭实验、划痕实验，并检测EMT标志物表达。
circCCDC719-13诱导TAMs铁死亡的机制探究
探究circCCDC719-13是否通过诱导铁死亡影响TAM极化。
检测TAMs中ROS、Fe2+、脂质过氧化、GSH水平及线粒体形态，并使用Ferrostatin-1（Fer-1）验证铁死亡参与。
鉴定circCCDC719-13下游靶点HSP90
确定circCCDC719-13的相互作用蛋白及下游靶点。
通过Co-IP、银染和质谱鉴定与circCCDC719-13结合的蛋白，并验证HSP90为下游靶点，检测HSP90表达及泛素化水平。
HSP90在circCCDC719-13调控TAM极化中的作用
验证HSP90是否介导circCCDC719-13对TAM极化和铁死亡的影响。
在TAMs中过表达HSP90或使用HSP90抑制剂（HSP90-IN-10），检测极化标志物、铁死亡指标及细胞因子分泌。
体内验证circCCDC719-13对前列腺癌生长和转移的影响
评估circCCDC719-13过表达的TAMs在体内对前列腺癌生长和淋巴结转移的影响。
将过表达circCCDC719-13的TAMs与PC3M细胞混合注射到裸鼠足垫，建立腘窝淋巴结转移模型，观察肿瘤生长和转移，并进行组织学分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离 | Ficoll-Hypaque分离液 | -- | -- |
| D14磁珠 | BioLegend | 480026 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | ExCellBio | FSP500 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 极化诱导 | 佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯 | Solarbio | -- |
| 干扰素-γ | MedChemExpress | -- | |
| 脂多糖 | Beyotime | -- | |
| 白细胞介素-4 | Beyotime | -- | |
| 白细胞介素-13 | PeproTech | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| RT-qPCR | HiScript II一步法qRT试剂盒 | -- | -- |
| SYBR qPCR预混液 | -- | -- | |
| ABI定量PCR仪 | ABI | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| Pierce BCA蛋白检测试剂盒 | Pierce | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | CD86抗体（FITC标记） | Elabscience | -- |
| CD163抗体（BV421标记） | Elabscience | -- | |
| 侵袭实验 | Matrigel基质胶 | BD Biosciences | -- |
| 结晶紫 | Solarbio | C8470 | |
| 显微镜 | CX33显微镜 | Olympus | -- |
| ROS检测 | DCFH-DA探针 | -- | -- |
| 流式细胞仪 | CytoFLEX S流式细胞仪 | Beckman | -- |
| 铁死亡检测 | Phen Green SK染料 | GLPBIO | GC40243 |
| C11 BODIPY 581/591染料 | GLPBIO | -- | |
| ELISA | ELISA试剂盒 | MEIMIAN | MM-51283H2/MM-0091H2 |
| GSH检测 | GSH标准曲线 | Abbkine | KTB1600-48T |
| 铁离子检测 | 铁标准曲线 | Leagene | TC1016 |
| 转染 | 携带circCCDC719-13的慢病毒载体 | Beijing Tsingke Biotechnology | -- |
| 携带HSP90的慢病毒载体 | Beijing Tsingke Biotechnology | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 体内实验 | BALB/c裸鼠 | -- | -- |
| 免疫组化 | DAKO EnVision检测系统 | Dako | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本处理与巨噬细胞分离 | 患者样本量（32例）、组织来源（癌组织及癌旁组织）、分离方法（Ficoll-Hypaque离心、CD14磁珠分选）、细胞密度调整（1×10^7 cells/mL） 阅读提示：Materials and methods - Clinical samples and isolation of primary macrophages |
| 巨噬细胞极化诱导 | M1极化条件（IFN-γ 20 ng/mL + LPS 500 ng/mL，48小时），M2极化条件（IL-4 20 ng/mL + IL-13 20 ng/mL，48小时），所用细胞系（RAW264.7、THP-1） 阅读提示：Materials and methods - Induction of macrophage polarization |
| TAMs生成与circCCDC719-13过表达 | TAMs生成方法（PMs与PC3M共培养48小时）、慢病毒MOI（50）、嘌呤霉素筛选浓度（5 μg/mL）及时间（7天） 阅读提示：Materials and methods - Cell lines and cell culture, Plasmids and transfection |
| 体外功能实验 | Transwell侵袭实验参数（细胞密度2×10^3、下室TAMs浓度2×10^5/mL、共培养时间36小时）、划痕实验观察时间点（0h和48h） 阅读提示：Materials and methods - Cell invasion assay, Wound healing assays |
| 铁死亡检测 | ROS检测探针浓度（DCFH-DA 5 μM）、Phen Green SK浓度（10 μM）、C11 BODIPY浓度（2 μM）、GSH检测细胞数（5×10^5）、Fe2+检测细胞数（2×10^6） 阅读提示：Materials and methods - ROS assay, Phen Green SK assay, C11 BODIPY assay, Intracellular glutathione (GSH) detection assay, Colorimetric assay for measurement of intracellular ferrous iron levels |
| 体内转移模型 | 动物品系（BALB/c裸鼠）、细胞注射比例（TAMs:PC3M = 4:1）、注射部位（足垫）、观察时间（24天）、样本量（n=5/组） 阅读提示：Materials and methods - In vivo popliteal LN metastasis and tumorigenesis assays |