构建Ccl7髓系特异性敲除小鼠及肿瘤模型
验证髓系细胞中Ccl7对CRC肿瘤生长的影响
将Ccl7f/f与Lyz2cre小鼠杂交获得Ccl7 MKO小鼠，腹腔或皮下接种MC38-luc或CT26-luc细胞，监测肿瘤生长和生存期。
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巨噬细胞CCL7通过调控巨噬细胞和CD8+ T细胞的浸润促进结直肠癌对免疫治疗的耐药性
Macrophage CCL7 promotes resistance to immunotherapy for colorectal cancer by regulating the infiltration of macrophages and CD8+ T cells
实验完整度
高涉及Ccl7髓系特异性敲除小鼠、MC38/CT26肿瘤模型、体外BMDM培养、流式、蛋白质组、RNA-seq、脂质组、Seahorse等，含功能验证与机制验证。
主要模型
Ccl7髓系特异性敲除小鼠（Ccl7 MKO，C57BL/6背景） MC38和CT26小鼠结直肠癌移植瘤模型 骨髓来源巨噬细胞（BMDMs) THP1、LLC、CT26、MC38、HT29细胞系
重点核对
Ccl7髓系特异性敲除小鼠的构建及PCR鉴定（Ccl7f/f与Lyz2cre杂交） MC38和CT26肿瘤细胞接种剂量：5×10^5个细胞，腹腔或皮下注射 重组Ccl7蛋白处理剂量：1 μg/mL（体外），50 μg/kg（体内） 抗Ccl7抗体剂量：100 μg/只，抗PD-L1抗体剂量：200 μg/只，腹腔注射 PI3K抑制剂BEZ235处理浓度：200 nM
摘要
背景
免疫检查点抑制剂（ICIs）已被证明是最有前景和最有效的免疫疗法之一；然而，它们在结直肠癌（CRC）中的疗效仍然非常有限。因此，了解CRC患者对ICIs治疗耐药的机制，对于开发新的抗肿瘤免疫治疗靶点具有重要意义。
方法
建立了Ccl7髓系细胞特异性敲除小鼠和MC38荷瘤小鼠模型，以研究Ccl7在CRC进展中的作用。使用蛋白质组学分析、RNA-seq和流式细胞术分析来确定Ccl7在肿瘤免疫微环境中的作用。
结果
在本研究中，我们发现肿瘤中升高的CCL7+肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）与CRC患者对ICIs阻断治疗的耐受性相关。髓系细胞中CCL7的缺失导致免疫抑制性TAMs的积累减少，并增加了肿瘤内活化CD8+ T细胞的浸润。机制上，CCL7调节过氧化物酶体生物发生和脂肪酸氧化，从而通过PI3K-AKT-PEX3信号通路促进TAMs的免疫抑制功能。此外，CCL7通过抑制AKT2-STAT1信号通路来抑制趋化因子CXCL10的表达，从而减少肿瘤中活化CD8+ T细胞的浸润。阻断CCL7可延缓CRC进展并增强PD-L1的治疗效果。
结论
我们的研究强调了CCL7+ TAMs在ICIs免疫治疗耐药中的新作用及其调控机制，提示CCL7可能作为ICIs免疫治疗的潜在联合治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CCL7+ TAMs在结直肠癌免疫治疗耐药中的作用及机制是什么？
- 核心机制
- CCL7通过CCR2激活PI3K-AKT信号通路，上调PEX3介导的过氧化物酶体生物发生和脂肪酸氧化，增强TAMs的免疫抑制功能；同时抑制AKT2-STAT1-CXCL10信号通路，减少CD8+ T细胞浸润，从而促进免疫治疗耐药。
- 主要证据
- Ccl7 MKO小鼠肿瘤生长减缓，TAMs积累减少，CD8+ T细胞浸润增加；CCL7处理BMDMs增强Arg1表达和脂肪酸氧化；Pex3敲低或BEZ235处理逆转CCL7效应；体内阻断CCL7与抗PD-L1联用显著抑制肿瘤生长并提高生存率。
- 研究意义
- CCL7可能作为结直肠癌ICIs联合免疫治疗的潜在靶点，靶向CCL7可能改善CRC患者对免疫治疗的反应。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
流式细胞术分析肿瘤免疫微环境
分析Ccl7敲除对肿瘤浸润免疫细胞组成和功能的影响
制备肿瘤单细胞悬液，进行表面和胞内染色，流式检测CD8+ T细胞、巨噬细胞、MDSCs等亚群及IFN-γ、GzmB等表达。
体外BMDM极化与CCL7处理
研究CCL7对巨噬细胞极化和免疫抑制功能的影响
分离培养BMDM，用LPS或IL-4诱导M1/M2极化，或用重组CCL7处理，分析iNOS、Arg1、MHC II、ROS等表达。
脂质代谢与线粒体功能分析
验证CCL7是否影响TAMs的脂肪酸氧化和线粒体生物发生
用Bodipy染料检测脂质积累，MitoGreen检测线粒体数量，Seahorse分析OCR和SRC，LC-MS分析脂肪酸代谢产物。
蛋白质组学和RNA-seq分析
筛选CCL7调控的下游蛋白和信号通路
提取Ccl7f/f和Ccl7 MKO TAMs的蛋白和RNA，进行蛋白质组学、RNA-seq，通过KEGG和GSEA富集分析。
CD8+ T细胞迁移和杀伤功能测定
验证CCL7对CD8+ T细胞浸润和功能的调控作用
使用Transwell实验评估TAMs条件培养基对CD8+ T细胞迁移的影响；体内用CFSE标记的CD8+ T细胞过继转移，检测肿瘤内浸润；共培养实验检测CD8+ T细胞增殖和IFN-γ/GzmB产生。
体内阻断CCL7及联合PD-L1治疗
评估靶向CCL7的疗效及与免疫检查点抑制剂的协同作用
给MC38/CT26荷瘤鼠腹腔注射抗Ccl7抗体、Bindarit、或抗PD-L1抗体，单独或联合使用，监测肿瘤生长和生存期。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 细胞处理 | 重组小鼠CCL7蛋白 | PeproTech | 250-08 |
| 信号通路抑制 | BEZ235 | Selleck | S1009 |
| 体内药物处理 | Bindarit | MCE | HY-B0498 |
| 体内抗体治疗 | 抗Ccl7抗体 | R&D Systems | AF-456-NA |
| 抗PD-L1抗体 | BioXcell | BE0101 | |
| 流式细胞术 | 可固定活力染料eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 |
| CD45抗体 | Biolegend | 147712 | |
| CD8α抗体 | Biolegend | 100706 | |
| IFN-γ抗体 | Biolegend | 505810 | |
| 颗粒酶B抗体 | Biolegend | 515403 | |
| CD3抗体 | Biolegend | 100206 | |
| CD4抗体 | Biolegend | 100412 | |
| CD11b抗体 | Biolegend | 101208 | |
| Gr-1抗体 | Biolegend | 108426 | |
| CD11c抗体 | Biolegend | 117308 | |
| MHC II抗体 | Biolegend | 107608 | |
| F4/80抗体 | Biolegend | 123116 | |
| B220抗体 | Biolegend | 103206 | |
| PD-L1抗体 | Biolegend | 124308 | |
| NK1.1抗体 | Biolegend | 108718 | |
| CCR1抗体 | Biolegend | 152508 | |
| CCR2抗体 | Biolegend | 150608 | |
| CCR3抗体 | Biolegend | 144512 | |
| ARG1抗体 | GeneTex | 42284 | |
| iNOS抗体 | Thermo | MA5-17139 | |
| Foxp3/转录因子染色试剂盒 | eBioscience | 00-5523-00 | |
| CFSE | Dojindo | C309 | |
| 脂质代谢分析 | Bodipy | -- | -- |
| 线粒体分析 | MitoGreen | -- | -- |
| Seahorse分析 | Seahorse XFe96分析仪 | Agilent | -- |
| Transwell迁移实验 | Transwell多孔板 | Corning | 07-200-149 |
| 基质胶 | BD Biosciences | -- | |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX | Thermofisher | 13778150 |
| ELISA | ELISA试剂盒 | Solarbio Life Science | -- |
| qPCR | RNAiso Plus | Takara | 9108Q |
| PrimeScript RT-PCR试剂盒 | Takara | RR014A | |
| TB Green快速qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 免疫荧光 | CD68抗体 | Abcam | ab53444 |
| CCL7抗体 | Invitrogen | MA5-29089 | |
| PMP70抗体 | Sigma-Aldrich | SAB4200181 | |
| 抗大鼠IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | CST | 4416 | |
| 抗兔IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | CST | 4414 | |
| DAPI | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| CCL7一抗 | Invitrogen | PA5-86885 | |
| Pex3一抗 | Proteintech | 30424-1-AP | |
| Acox1一抗 | Proteintech | 10957-1-AP | |
| p-PI3K一抗 | CST | 4228 | |
| PI3K一抗 | CST | 4249T | |
| p-AKT1一抗 | CST | 2938 | |
| AKT1一抗 | CST | 9018 | |
| AKT2一抗 | CST | 3063 | |
| Stat1一抗 | CST | 9172 | |
| β-actin一抗 | Sigma-Aldrich | A1978 | |
| 脂质组学分析 | 液相色谱-质谱联用仪 | -- | -- |
| 测序 | Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系：Ccl7f/f和Ccl7 MKO（C57BL/6背景），以及C57BL/6和BALB/c野生型小鼠；年龄6-8周；肿瘤细胞接种数量5×10^5；接种途径（腹腔或皮下）。 阅读提示：详见'Animals and tumor models'小节，尤其是第一至第三段。 |
| 细胞培养与处理 | BMDM分离与培养方法（参考已发表文献）；重组CCL7浓度（1 μg/mL）和处理时间；BEZ235浓度（200 nM）；LPS和IL-4浓度（20 ng/mL）；HT29条件培养基浓度（10%）。 阅读提示：详见'Cell lines and treatment'和'Cell culture'小节，以及图3和图5的图注。 |
| 流式细胞术 | 抗体型号和稀释比例（1:100）；死活染料（Fixable Viability Dye eFluor 780）；固定破膜试剂盒（Foxp3/Transcription Factor Staining Kit）；染色时间及温度。 阅读提示：详见'FCM'小节，以及各图注中详细说明。 |
| 蛋白质印迹 (Western blot) | 所用抗体的来源和货号，以及使用浓度（1:1000）；细胞裂解方法（RIPA缓冲液，离心条件）；检测蛋白包括CCL7、Pex3、Acox1、p-PI3K、PI3K、p-AKT1、AKT1、AKT2、Stat1和β-actin。 阅读提示：详见'Western blot'小节，具体抗体信息可在Methods中找到。 |
| 体内治疗实验 | 药物剂量和给药方式：抗Ccl7抗体（100 μg/只，腹腔注射，每3天），抗PD-L1抗体（200 μg/只，腹腔注射，每3天），Bindarit（5 mg/kg，灌胃，每3天），重组CCL7蛋白（50 μg/kg，腹腔注射，每3天）。 阅读提示：详见'Animals and tumor models'小节中的治疗部分，以及图7图注。 |