教你一天搞定免疫组化

• 在室温下，用2%多聚甲醛将新鲜解剖的组织(<3mm厚) 1小时或过夜固定。

• 用流动的自来水冲洗组织5分钟。

• 用70％，80％，95％的酒精分别使组织脱水，每次5分钟，然后用100％的酒精3次脱水，每次5分钟。

• 用二甲苯清洗组织2次，每次5分钟。

• 将组织浸泡在石蜡中3次，每次5分钟。

• 将组织包埋在石蜡块中(可以在室温下保存多年)。

• 在切片机上将石蜡包埋的组织块切成5-8μm的厚度，并漂浮在含有蒸馏水的40°C水浴中。

• 将切片转移到适合免疫组织化学的载玻片上。

• 切片后65℃，烘干6小时。
   

• 将玻片在二甲苯中脱蜡2次，每次10分钟。

• 将玻片转移到无水乙醇中2次，每次5分钟，然后分别通过95％，85％酒精一次，每次3分钟。

• 用自来水冲洗玻片2次，洗掉酒精。

我们一般有使用两种修复方法，常以碱性Tris EDTA修复液为主，如果效果不好会换成酸性的。

• 1XTris EDTA 修复液 PH8.0 

  Tris Base 1.21g EDTA 0.37g ddH2O定容至1L Hcl调整PH 8.0

   

• 1X 1M 柠檬酸缓冲液 PH6.0

  柠檬酸钠 3g 柠檬酸 0.4g ddH2O定容至1L。

将300 ml 抗原修复液倒入染色容器中微波先将修复液加热15min，然后加入载玻片，中火微波15min，冷却至室温1h，可放在冰袋附近，但不可降温太快，防止载玻片破裂。(抗原修复液：cat#CPL,CBB(PH=6) cat#ETA、TES(PH＞6)cat#PSS（胃蛋白酶）cat#TSS（胰蛋白酶））
 

使用免疫组化笔，把待染色组织圈起来，以节约试剂使用。(免疫组化笔：cat#KPM)然后使用3% H2O2 室温孵育12min后 ，自来水洗，暂时浸泡在PBS中。(过氧化氢封闭液：cat#ACA)

使用ddH2O 配置的5%羊血清 37℃条件下孵30min后，将羊血清倒干净即可。（通用型封闭液：cat#AAA）

一抗：将100μl适当稀释的一抗（在抗体稀释缓冲液中，例如含有0.5％BSA的PBS）涂在玻片上的组织切片上，37℃孵育 1h后。PBST（PBS+1%吐温20）洗3次。（一抗稀释液：cat#APG,ATG（绿色）cat#ABB，ADT（无色）

二抗：2滴/片 37℃孵育30min, PBST洗3次。（多价二抗:cat#ABN,反应种属:  小鼠，大鼠，兔，豚鼠 ；通用型二抗稳定剂cat#SZ03)

注：如果用的是生物素标记的二抗，应当加一步链霉亲和素偶联的HRP复合物37℃孵育15min。

A B液：50 μl色原+1ml底物。现配现用，7min内观察，有明显的组织显现就立即终止(PBS)，7min后还是不显色说明该组织不会显色，需终止反应。自来水冲洗3遍。底物:cat#ACV(DAB) cat#PRD(Permanent Red）cat#FRT(Fast-Red ）

使用过的苏木素再次使用前要先捞出液体表面的一层氧化膜，然后染色90s，自来水冲洗3次。

75%乙醇+1%Hcl分化 1s后，自来水冲洗3次。

注：目的是通过调整PH分化细胞膜和细胞质。

之后使用二甲苯孵育10min。

封片剂：cat#AML（水性）cat# FMM（荧光水性）cat#PMT（通用型）

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