抗体标记荧光简单两步走

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Readilink抗体标记试剂盒

简单快速无需纯化，即只需要反应（30-60min）和终止反应（10min）两步即可。

原理示意图

标准操作实验步骤（标记50μg蛋白质）

    将所有组分恢复室温并在打开前将样品瓶短暂离心，并在开始标记前立即准备所需的溶液。 以下操作步骤仅供参考。

1.准备蛋白质溶液（溶液A）：

注意1：如果您的蛋白质浓度不同，请相应调整蛋白质体积，使约50μg蛋白质可用于标记反应。

注意2：要标记100g蛋白质（假设目标蛋白质浓度为1mg / mL），将10μL（总反应体积的10％）反应缓冲液（组分B）与100μL目标蛋白质溶液混合。

注意3：蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中;如果蛋白质溶解在甘氨酸缓冲液中，必须用1X PBS（pH 7.2-7.4）透析，或使用Amicon Ultra-0.5，Ultracel-10膜，10 kDa（来自Millipore的cat＃UFC501008）去除广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（如硫酸铵和乙酸铵）。

注意4：不纯抗体、牛血清白蛋白（BSA）或明胶稳定的抗体不能被很好地标记。

注意5：为获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为1-2 mg / mL。如果蛋白质浓度小于1 mg / mL，则结合效率显着降低。

2.运行结合反应：

注意：如果要标记100 μg蛋白质，请使用两个小瓶（组分A），将100 μg蛋白质分成2 x

50 μg蛋白质，并使每个50 μg蛋白质与一小瓶标记染料反应。然后将两个小瓶合并用于下一步。

2.2将结合反应混合物在室温下孵育30-60分钟。

注意：如果需要，可以旋转或摇动结合反应混合物更长的时间。

3.停止结合反应：

3.2在室温下孵育10分钟。

3.3标记的蛋白质（抗体）现在可以使用了。

Buccutite抗体大分子蛋白标记试剂盒

反应快：在5-9的PH范围内反应1-2小时，形成稳定的抗体荧光结合物。

操作简便效率高：试剂盒核心成分Buccutite MTA和Buccutite FOL。分别将MTA连接到抗体（蛋白质）中，FOL连接到蛋白荧光或者HRP等蛋白上，再将两种蛋白混合后连接，即可获得标记抗体，同时有效避免抗体或蛋白发生自交联，从而有更高的标记效率。

原理示意图

操作步骤

抗体工作液准备：

为了标记100 μg抗体(假设目标抗体浓度是1 mg/mL), 将 5 μL (反应总体积的5% ) 反应缓冲液 (组分 C) 与100 μL目标抗体混合。

1.Antibody-Buccutite MTA反应

1.1将抗体溶液直接加入到Buccutite MTA（组分B）的小瓶中，移液器反复吹吸几次或者

涡旋几秒混匀。

1.2将抗体-Buccutite MTA反应混合物在室温下孵育30-60分钟。

注意：如果需要，抗体-Buccutite MTA反应混合物可以旋转或摇动更长时间。

2.准备纯化柱用于抗体-Buccutite MTA纯化

2.1将提供的纯化柱（组分D）反转几次以重新悬浮沉降的凝胶并去除任何气泡。

2.2取下尖端并将纯化柱放入洗涤管（2 mL，未提供）中。取下盖子，让多余的填料缓冲液通过重力排放到凝胶床的顶部。如果纯化柱没有开始流动，请将盖子推回纯化柱并再次将其取出以开始流动。丢弃排出的缓冲液，然后将纯化柱放回洗涤管中。但是，如果将纯化柱放入12 x 75 mm试管（未提供）中，请立即离心。

2.3在摇动式离心机中以1,000×g离心2分钟（参见“离心注意事项”部分）以除去包装缓冲液。丢弃缓冲液。

2.4向柱中加入1-2 mL 1X PBS（pH 7.2-7.4）。每次添加PBS后，让缓冲液通过重力排出，或将纯化柱离心2分钟以除去缓冲液。丢弃收集管中的缓冲液。重复此过程3-4次。

2.5在摇动式离心机中以1,000×g离心2分钟（参见“离心注意事项”部分）以除去包装缓冲液。丢弃缓冲液。

3.纯化抗体-Buccutite MTA溶液

3.1将柱（来自步骤准备纯化柱用于抗体-Buccutite MTA纯化）置于干净的收集管（1.5mL，未提供）中。小心地将样品（约105μL，来自Step Antibody-Buccutite MTA反应）直接加载到纯化柱中心。

3.2上样后，加入5μL 1XPBS（pH 7.2-7.4），使总体积为110μL。将柱以1,000xg离心5-6分钟，并收集含有所需抗体-Buccutite MTA溶液的溶液。

4.1通过向Buccutite FOL活化的PE（组分A）的小瓶中加入50μL ddH₂O制备Buccutite FOL活化的PE溶液，移液枪反复吹吸几次充分混合，或者将小瓶涡旋几秒钟混匀。

4.2将整瓶Buccutite FOL活化的PE溶液混合到纯化的抗体-Buccutite MTA溶液（来自步骤纯化抗体-Buccutite MTA溶液）中，充分混合并在室温下旋转混合物1小时。

4.3抗体-PE结合物现在可以使用了。

注意：立即使用时，抗体-PE结合物需要用您选择的缓冲液稀释。

注意：对于长期储存，需要浓缩或冷冻干燥抗体-PE结合物溶液。

      抗体结合物应在载体抗体（例如0.1％牛血清白蛋白）存在下以> 0.5mg / mL储存。当在2mM叠氮化钠存在下储存并避光时，抗体-PE缀合物溶液可以在4℃下储存两个月而没有显着变化。对于更长时间的储存，可以将抗体-PE缀合物冻干并在≤-20℃下储存。

6.1纯化柱（组分D）可以装入2mL微量离心管或12×75mm试管中，用于在离心过程中收集样品。使用2 mL微管和纯化柱进行初始平衡步骤。

6.2能够产生1,000 x g的最小力的摆动式离心机适用于Bio-Spin柱。在特定转速下产生的重力是微量离心机转子半径的函数。有关从每分钟转数（RPM）到离心力或g力的转换信息，请参阅摆动式离心机说明手册。或者，使用以下等式计算达到1,000 x g重力所需的RPM速度。

6.3 RCF（xg）=（1.12 x 10-5）×（RPM）×2×r（RCF是相对离心力，r是从转子中心到Bio-Spin柱中间测量的以厘米为单位的半径 ，RPM是转子的速度）。

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