高质量单细胞悬液制备指南！

单细胞悬液是生物医学研究中重要的实验样本，在单细胞悬液制备过程中，细胞凋亡和机械损伤释放的基因组DNA，是形成黏稠团块、导致制备失败的主要元凶。DNase I是一种能特异性切割DNA链的酶，在单细胞悬液制备中，它能够高效降解细胞外的基因组DNA，从而降低溶液黏度。今天，我们就来学习下如何利用DNase I（脱氧核糖核酸酶）制备高质量单细胞悬液。

 

第一步：样本预处理

1.  对组织块进行机械破碎和酶学消化（如使用胶原酶、胰蛋白酶等），直至组织基本分散。

2.  将初步的细胞混合物转移至一个预冷的无菌离心管中。

3.  加入适量的预冷PBS（或特定的终止缓冲液）以稀释和终止蛋白酶的消化反应，防止过度消化。

4.  通过适当孔径的细胞筛（如70μm或40μm）过滤，去除未消化的大块组织（此时的滤液有些黏稠）。

 

第二步：DNase I处理

1.  使用无菌的PBS稀释DNase I原液至工作浓度。

2.  将准备好的DNase I工作液直接加入过滤后的细胞悬液，轻柔地吹打混匀，确保酶与悬液充分接触。

3.  温和孵育：将离心管置于37℃水浴或培养箱中，孵育 5-15分钟。可轻柔颠倒混匀一两次。

 

第三步：反应终止

1.  向离心管中加入足量的、含血清的完全培养基以终止反应。

2.  在4℃条件下，以300-500 g的离心力离心5分钟。

3.  缓慢地倒掉或吸出上清液，注意不要扰动底部的细胞沉淀，去除DNase I以及被切割的DNA小片段。

4.  用预冷的PBS重悬细胞沉淀，再次离心并弃去上清。重复此步骤一次，以确保彻底清除DNase I。

 

第四步：重悬与质检

1.  使用适量适合后续实验的缓冲液（如无血清培养基或PBS+0.04% BSA）轻柔地重悬细胞沉淀。

2.  使用台盼蓝排除法或其他活率检测方法进行细胞计数。此时，在显微镜下观察，细胞应呈现良好的分散状态，无明显团块。

3.  用移液器吸取少量细胞悬液，悬液应易于通过，无任何拉丝或黏稠感；调整细胞至目标浓度，即可准备实验。

 

Tips

1. DNase I处理的最佳时机是在组织解离之后、任何精细操作（如细胞分选）之前。

2. 对于特别容易发生细胞死亡的组织（如肿瘤、脑组织），可能需要适当增加DNase I的浓度或延长孵育时间。

3. DNase I只解决DNA引起的团块。如果团块是由细胞表面蛋白或细胞碎片引起，则需要考虑使用其他优化解离方案。