荧光定量PCR（qPCR）技术教程3：逆转录引物怎么选？一次性讲透

RNA定量能不能准，第一步就看逆转录。逆转录引物选错，后面qPCR再优化也白搭。今天把实验室最常用的三类逆转录引物拆开讲，让你一次性搞懂该怎么选。

 

01 为什么引物类型会影响结果

 

逆转录引物类型决定了cDNA的合成范围，Oligo（dT）只针对mRNA，信息完整但可能偏重3’端；随机引物覆盖所有RNA，背景复杂；基因特异性引物仅针对单一目标，灵敏度最高但通量低。引物选择不当会导致目标基因检测失败、定量不准或背景高，从而影响实验结果。

 

02 三大逆转录引物对比

 

Oligo（dT）：

Oligo（dT）是一种由多个脱氧胸苷酸（dT）串联而成的寡核苷酸单链，即只含胸腺嘧啶的寡核苷酸链。Oligo（dT）与mRNA的Poly（A）尾巴可以发生特异性结合，因此主要用于逆转带有Poly（A）尾的mRNA。

优点：背景干净，rRNA、tRNA基本不逆转录；有利于长链或全长mRNA的逆转录。

缺点：只能用于有poly（A）的RNA；对RNA样品的质量要求较高，RNA降解或片段化时，5′端信息丢失，全长cDNA合成量会大量减少。

 

随机引物：

随机引物是一系列人工合成的、序列随机的短链单链寡核苷酸混合物，一般6到8个碱基。当特定mRNA由于含有使逆转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。可用于mRNA、rRNA、tRNA等各种RNA的逆转录，对于具有复杂二级结构/GC含量较高，来源为原核生物的模板也同样适用。

优点：适用几乎所有RNA样本，包括降解样本、原核RNA、非编码RNA等。

缺点：特异性差，可能出现假阳性；低丰度模板信号可能被“淹没”。

 

基因特异性引物：

基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物，需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。特异性引物通常用于一步RT-qPCR实验中，对于低丰度基因尤其适用。

优点：特异性强，灵敏度高；无rRNA背景，qPCR模板“纯度”高。

缺点：一个基因一条引物，成本高，不适合多基因；设计难度大，引物二聚体或RNA二级结构会拉低效率。

 

03 逆转录引物选择一览

 

我们根据以上信息总结了如下表格，大家可以根据表格一目了然地选择合适的逆转录引物。

【注】为提高反转录效率，并保障获得更加完整的cDNA，可以将Oligo(dT)和随机引物混合使用。