cDNA质量如何把控？

在RT-QPCR实验中，已经将RNA逆转录成cDNA，但获得的cDNA，大家通常会用Nanodrop来测定其浓度和纯度，这样正确吗？得到的cDNA是否存在基因组DNA（gDNA）污染从而影响后续的qPCR实验呢？现在就为大家解读一下。

cDNA不需要用Nanodrop测量浓度和纯度

为什么逆转录后的cDNA不需要用Nanodrop来检测浓度与纯度呢？因为逆转录后的产物是一个混合体系（含有cDNA、未完全逆转录的RNA、dNTP、残余的引物以及各种蛋白和盐离子等成分），会干扰cDNA的吸光度。此外，260 nm是核酸吸收峰最高的位置，在这个位置，1 OD（optical density，光密度）的吸光度分别相当于50 ng/μL的双链DNA，37 ng/μL的单链DNA，40 ng/μL的RNA，30 ng/μL的寡核苷酸（dNTP）。因此，就dNTP而言，即使cDNA浓度一样，dNTP也会严重干扰其测定结果。

为此，我们专门进行了验证，以进一步说明dNTP 投入量对cDNA浓度检测结果存在的影响。以小鼠肌肉组织RNA为模板，采用不同品牌试剂分别进行逆转录实验，RNA 投入量为500 ng，逆转录体系及程序分别按各自说明书进行。采用Nanodrop测定cDNA浓度，并取相同体积cDNA分别进行qPCR实验，结果证明：不同品牌逆转录产品的cDNA浓度相差较大，但定量实验Ct值几乎一致。逆转录体系中dNTP 投入量的多少会使cDNA浓度的测定结果产生较大差异，但最终Ct值几乎一致。

图1.qPCR检测结果△Ct＜1，且 Ct 值与 Nanodrop 定量结果无线性关系

因此，cDNA浓度的测定值是不准确的，逆转录实验之后无需测定浓度。RT-qPCR是一个多步骤连贯实验，正是因为cDNA无法鉴定，只能通过后续qPCR实验才能呈现结果。

gDNA污染的识别与去除

gDNA的污染主要来源于RNA模板， 那如何识别RNA模板中是否仍含有gDNA残留呢？可以在逆转录之前将RNA模板进行琼脂糖凝胶电泳验证。如下图所示，泳道上部有明显的高分子杂带，则可能有gDNA的残留，不建议用于后续的qPCR实验，会对实验的准确性造成影响。

 图2. 高质量RNA（左）和RNA中有gDNA（右）

如果逆转录前没有确认模板中是否含有gDNA，可以在qPCR实验中设立NRC阴性对照组（以未逆转录的RNA作为模板）验证，如果NRC具有明显的扩增，表明RNA中可能含有gDNA污染。

那么该如何去除gDNA污染呢？通常可以在RNA提取时或逆转录前用DNA酶或gDNA清除剂去除gDNA。为此，Arcegen提供了1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA digester plus, for qPCR)（Cat#N132061）可有效去除逆转录过程中gDNA的残留。