小鼠皮下成瘤详细实验步骤

一、实验步骤

1、收集指数生长期、密度在80-90%的细胞，至无菌离心管中。

注意：细胞应在指数生长阶段收集，细胞状态极大影响细胞系移植的活力。如果细胞系异种移植的肿瘤活力差，则可以将Matrigel用作注射混合物，为植入提供丰富的基质环境。

2、细胞在4℃，1500rpm离心5min，去除上清液并将细胞均匀重悬于1mL PBS中，离心清洗2~3遍。使用胰酶消化细胞。加入PBS或无血清培养基制成细胞悬液，离心清洗1~2次去除胰酶，重悬至终浓度为1-5×10⁸个细胞/mL，置于冰盒中。

注意：确保细胞悬液均匀混合以获得准确的细胞计数。细胞消化后应尽快接种到裸鼠皮下，一般尽量在半小时内完成（如果接种量大，可以分批接种）。

3、将细胞悬液和基质胶在4℃环境下按1:1比例进行稀释，制备成终浓度为1-5×10⁷个细胞/mL，置于冰盒中。在接种前，使用枪将细胞悬液充分吹散，以确保细胞均匀分散，防止细胞聚集并降低其存活率。

注意：将细胞悬液放在冰上降低细胞的代谢以保持细胞的活性及防止出现凝胶现象。

4、皮下瘤接种体积为100-200μL，种植部位为血供丰富区域，如腋窝中后部、腹股沟中上部。接种时，用拇指和食指抓住肩膀上的皮肤，防止小鼠将注射器踢开，将动物保持在直立位置。用75%乙醇棉球轻轻消毒背部皮肤2-3次。

5、轻轻地将针插入背侧的皮肤以到达皮下袋，避免下面的肌肉层。轻轻推入注射器中的细胞，在拔出针头之前停留几秒钟，以防细胞悬液漏出。

注意：注射前，一定要排去针管内的空气。在接种时，针头应深入皮下约1厘米，以减少注射后细胞悬液从针眼溢出的可能性。注射时，针头应向前方穿行，且在注射前轻微移动针头，以确保针头处于皮下。如果针头能够移动，则表明它在皮下位置，否则可能在皮内或肌肉内。

6、将裸鼠放回笼内继续饲养，每天监测裸鼠的存活和肿瘤生长的体积，同时观察小鼠的精神状态、体重、饮食情况。大约1周-1月左右可看到肿瘤出现，并根据实验设计在肿瘤体积不超过1000mm³前对裸鼠进行死亡处理，并拍照。

注意：在避免肿瘤过大（>1500 mm3）导致动物过度负担。

7、取下瘤子后，将一部分冻存于液氮中，以备将来提取蛋白质和RNA使用；另一部分则用福尔马林固定，用于免疫组化、免疫荧光等实验。

二、注意事项

1、细胞

1）细胞系特性

不同细胞株的成瘤快慢会有差异，建议正式实验之前开展预实验，摸索细胞株成瘤性，同时参考已发文献。

2）细胞状态

细胞培养操作过程要注意防止污染。支原体污染极为常见，会改变培养细胞的代谢、增殖特征及形态等，从而影响肿瘤生长和结果的可重复性。建议接种前对细胞进行支原体检测。

细胞活力是影响肿瘤形成的重要原因，接种细胞建议取处于对数期生长的细胞，接种前对细胞活率进行检测，接种过程中细胞置于冰上，保持低温，接种完成后也可以留一小部分细胞检测细胞活率，确保接种过程中细胞活率没有明显降低。另外，注意避免体外过度传代影响细胞状态（一般3-5代）。

2、动物

常用的免疫缺陷小鼠品系有：裸鼠、NOD-Scid、NCG等。不同免疫缺陷程度的小鼠或小鼠不同周龄的成瘤速度有所差异，建议根据预实验结果选择合适的动物模型，同时参考已发表的文献。选择小鼠周龄不宜过大，如，裸鼠8周龄以上NK细胞等免疫细胞活力开始增强，一般来说，4～6周龄的裸鼠更容易成瘤，这时免疫系统不够强，成瘤率相对较高。

3、接种部位

皮下注射主要有4个位点（如下图所示），建议根据细胞株成瘤性和实验目的选择合适的接种部位。一般认为腋下皮下（3号位）血供充足，利于肿瘤细胞增殖，且右侧操作较方便。如果个别瘤种生长速度较快，可以接种后肢或背部等供血量不是特别充足的地方，或者降低细胞接种剂量，减缓肿瘤生长速度。

4、接种量

不同的细胞系、不同的小鼠和接种位置所需要的细胞剂量会有差异，建议正式实验之前开展预实验，接种量设置多个梯度，摸索出最佳细胞注射剂量。

另外，可以根据细胞株类型选择实验中是否需要添加辅助因子，常规肿瘤细胞按1:1添加基质胶即可，卵巢癌一般均会加雌激素，接种细胞后单独注射雌激素。

5、饲养管理

小鼠在运输过程中会产生应激反应，使小鼠出现一系列的病理生理学变化，这些变化会增加某些实验误差，因此在接到动物后应尽量避免立即进行实验，建议让动物有1~2周的适应期。保持饲养环境的专业，免疫缺陷小鼠必须饲养在SPF级屏障设施内，且与免疫正常小鼠饲养在不同房间；裸鼠长期暴露在弱抗原的刺激下，NK细胞等免疫细胞的活力逐步增强，会导致裸鼠对肿瘤的非特异性免疫力增强；NCG及NCG相关背景品系是重度免疫缺陷模型，对病原体易感，饲养环境应清洁消毒到位。

三、FAQ

1. 为什么要用裸鼠而不用普通的小白鼠？

裸鼠是无胸腺等免疫器官，免疫力低，对肿瘤细胞没有免疫作用，容易成瘤。而常规的小白鼠具有正常免疫力的动物，移植肿瘤细胞后，会出现免疫排斥反应，进而可能会影响成瘤效果。

2. 按照正确步骤操作后，为什么没有肿瘤长出来？

可能原因：1、细胞状态差；2、细胞不易成瘤，需要加入基质胶辅助或增加细胞接种量，甚至更换细胞系再测试。3、小鼠周龄不合适，免疫功能完善导致无法成瘤，或者小鼠产生免疫排斥，需要更换免疫缺陷程度更大的小鼠进行测试。4、肿瘤生长速度满一周左右时间可以观察到肿块出现，瘤体形成时间可能需要1-2个月，注意观察和记录。

3. 瘤体长出来后又消失是什么原因呢？

肿瘤细胞接种后，如果出现肿瘤块先缩小，后变大的现象，可能是炎症反应，肿瘤细胞被机体自身吸收导致瘤体缩小或消失。若后续瘤体依旧没有变大，可以更换免疫缺陷程度更大的小鼠进行实验研究。

4. 同一实验组内出现瘤体大小不一是什么原因？

可能和小鼠个体差异、周龄大小、接种的细胞量、接种操作等有关。

5. 瘤体长到多大才合适？

根据动物伦理与福利的规定，小鼠肿瘤重量不可超过小鼠体重的10%，任何一个维度的瘤体大小不应该超过15mm。其中探究与疾病相关的生物标志物动物实验，实验周期较短，可选用150-250mm³范围的肿瘤；探究药物治疗效果，实验周期较长，建议使用50-150mm³范围的肿瘤。

6. 肿瘤形态奇形怪状，如何准确测量？

接种细胞悬液后，每日观察裸鼠的状态和行为表现，注意任何异常反应并作记录。位于动物体表的瘤体可以用游标卡尺测量，位于体内的瘤体可以通过动物活体荧光显像等测量，或者动物死亡处理后进行测量。较为准确的肿瘤体积计算公式：体积=（长度*宽度²）/2。

7. 为了增加成瘤的成功率，是否可以在同一只小鼠上多点接种？

不可以，一只小鼠只能接种一点， 若多点接种后形成多个瘤体，可能会相互影响。

8. 皮下成瘤过程中，小鼠出现坏死或溃疡的现象，该如何处理？

可能存在感染问题，建议对小鼠进行药物治疗或抗生素的预防等。若坏死或溃疡病灶长度不超过1.5cm，且持续超过48-72h不愈合，可能需要实行死亡处理。

9. 如何处理成瘤实验研究后的小鼠？

按照所在研究机构的动物伦理与福利的相关规定，需设置适当的人道研究重点，当实验动物出现以下症状时需要实行死亡处理：动物体重持续下降、动物各器官排泄分泌物、严重腹泻、瘤体快速增长造成溃烂、坏死或感染等。

10. 如何判断肿瘤是否出现了转移?

①病理剖检。如果肿瘤出现了转移,在肝脏或者肾脏等组织上肉眼可见明显转移灶。

②小动物活体成像。如果接种的肿瘤细胞带有荧光标签或者荧光素酶,可以借助小动物活体成像仪进行观察肿瘤转移情况。

③小动物核磁。核磁技术可以更明细那地观察到肿瘤细胞在肝脏,肺脏或者其他器官的转移情况。

四、产品推荐

产品归类	产品名称	货号	规格
基质胶	Arcegel Matrix LDEV-Free；Arcegel基质胶，无LDEV	C231001	5 mL/10 mL
	Arcegel Matrix High Concentration, LDEV-Free；Arcegel高浓度基质胶，无LDEV	C231005	5 mL/10 mL
支原体检测	DfCell Mycoplasma LAMP Detection Kit；DfCell支原体快速检测试剂盒（LAMP）	C230105	25 T/100 T
	DfCell Mycoplasma qPCR Detection Kit；DfCell支原体快速检测试剂盒（qPCR）	C230106	25 T/100 T
细胞活力检测	ATP BioLumi Cell Viability Assay Kit ；ATP荧光法细胞活力检测试剂盒	C331309	10 mL/100 mL
	ClearV Cell Counting Kit (CCK-8)；ClearV CCK-8试剂盒	C331301	100T/500T/1000T