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【以药找靶】中药单体找靶黄金组合Exploration IF 30.4：小分子Pull-down-MS+MST+CETSA+DARTS+APEX2黄芩素靶向eEF1A1阻断eEF1A1/Prdx4互作治疗脓毒症肺损伤

蛋白质-蛋白质互作（Protein-Protein Interaction, PPI）研究通常并非完成单一实验即可结束。完整的研究路径一般包括：发现候选互作蛋白、验证互作真实性、确认直接结合与亲和力、解析互作界面与结构机制。不同技术对应不同层次的科学问题。下文按此逻辑依次梳理。

：LiP-SMap通过限制性蛋白水解结合定量质谱，无需修饰化合物即可捕捉小分子诱导的蛋白结构变化，实现复杂蛋白质组中的潜在靶点筛选。本文介绍其技术原理与实验流程，并结合金丝桃苷靶点DHX9的鉴定案例展示其应用。

本研究鉴定肠道胆固醇诱导激素 Cholesin，并阐明其通过受体 GPR146 抑制肝脏胆固醇合成的机制。为获得可定量互作的重组蛋白，作者采用昆虫细胞-杆状病毒系统在Hi-5细胞中表达纯化全长GPR146（WT及mut）与Cholesin重组蛋白。通过MST测定二者结合亲和力，为 Cholesin与GPR146 直接互作提供定量证据。

共价小分子药物通过与靶标蛋白特定位点形成稳定共价键，实现持久、高效的功能调控。要精确鉴定小分子如何结合、在哪个氨基酸残基上，Bottom-up质谱策略是目前最成熟、最可靠的核心手段。

本文以银杏来源天然产物bilobalide为起点，通过分子编辑获得BB10，并利用CETSA-MS无偏找靶锁定PREP。随后通过CETSA-WB、MST、酶活实验、分子对接和突变体验证，证明小分子可直接结合PREP并抑制其活性，形成从天然产物改造到分子互作验证的完整流程。

本文系统介绍作者如何通过IP-MS、CoIP、GST Pull-down、PLA与IF五项技术，从筛选CHAF1A互作网络到原位验证其与RAD51/KU70的周期依赖性结合，最终阐明其促进RAD51加载驱动同源重组、介导肿瘤放射抵抗的分子机制。

文章聚焦UFMylation修饰通路中的E3复合体关键互作DDRGK1-UFL1。研究通过虚拟筛选联合NanoBRET高通量活细胞筛选，发现Osimertinib和新型小分子CP-24可破坏DDRGK1-UFL1相互作用，抑制全局类泛素化的蛋白翻译后修饰，诱导内质网应激，并在胶质母细胞瘤模型中表现出抗肿瘤和免疫微环境重塑作用。

共价或非共价小分子药物与靶标蛋白的结合位点鉴定，是理解作用机制与优化药物结构的关键。PAL-MS利用携带光敏基团的探针，在紫外光激活下原位形成稳定共价交联，再通过Bottom-up质谱策略精确定位结合位点。该方法可直接提供“在哪个氨基酸残基上结合”的高分辨率证据。  

本文从天然产物中筛选活性二萜生物碱，通过小分子生物素探针pull-down-MS锁定候选靶点，并结合CETSA、DARTS、免疫荧光共定位、LiP-MS、分子对接和分子动力学模拟，系统验证小分子与蛋白结合、细胞内稳定性变化及下游信号调控机制。

本文介绍热蛋白质组学（thermal proteome profiling）的基本原理、实验流程及在小分子药物靶点发现中的应用，并分享一篇TPP筛选天然小分子作用靶点的研究案例，展示从候选靶点筛选到直接结合及关键作用位点验证的完整研究思路。

这篇文章用AP-MS化学蛋白质组学把小分子作用靶点和蛋白互作机制一步步拆开：先找到小分子结合蛋白，再找到细胞内帮助PI3Kα被激活的互作因子，最后用ITC和晶体结构解释分子胶如何增强蛋白—蛋白相互作用。

分子对接只是基于计算机算法的理论预测，不能证明化合物与靶蛋白在现实中发生物理结合。要证明“化合物—靶点”或“蛋白—蛋白”互作，需要建立完整证据链：计算预测 → 体外生物物理验证 → 细胞原位验证 → 结合位点确认 → 功能闭环。本文汇总20+种验证方法，覆盖SPR、BLI、MST、ITC、FP、CETSA、FRET、PLA、Pull-down-MS、DARTS-MS、TPP、LiP-MS、ABPP、Co-IP、X-ray、Cryo-EM、NMR、定点突变等，并给出选择建议。

SPR（表面等离子体共振）作为研究生物分子相互作用的黄金标准，能够精确量化分子间的亲和力与动力学。本指南旨在系统性地介绍SPR实验的完整流程，帮助研究人员深入理解每个环节的关键要点，从而获得高质量、可信赖的实验数据。

膜蛋白的纯化过程中面临着不稳定、丰度低、难纯化等问题，无法得到高质量和纯度好的膜蛋白开展体外分子互作实验。在细胞中表达GFP/YFP-目标蛋白融合蛋白，利用细胞裂解上清液进行MST检测，解决难以重组表达纯化的蛋白不能做体外分子互作的难题。

研究蛋白与蛋白的相互作用常见的技术包括BiFC、FRET、BRET、Co-IP、Pull-down、酵母双杂交等，然而这些技术主要存在无法定量分析结合的强度及假阳性等问题。利用微量热泳动技术(MST)技术，可以定量分析蛋白质与蛋白结合亲和力。

在细胞中表达GFP/YFP-目标蛋白融合蛋白，将细胞裂解并离心后取上清液。直接利用细胞裂解上清液直接进行微量热泳动 (MST) 检测，解决难以重组表达纯化的蛋白不能做体外分子互作的难题。

通过农杆菌或者转基因植物表达目标蛋白与GFP（YFP）的融合蛋白，提取侵染后烟草叶片或转基因植物的总蛋白进行MST实验，可以解决MST实验中植物蛋白难以纯化的问题。

利用分子对接和动力学模拟预测药物与靶点蛋白的结合模式，确定关键氨基酸位点。通过突变这些氨基酸并进行微量热泳动实验，比较突变型和野生型蛋白与药物的亲和力。如果突变导致蛋白与药物亲和力降低或不结合，则该位点是药物与蛋白的关键结合位点。

研究多个分子间竞争性结合是药物研发和信号通路的常用实验手段，如何检测多个分子间的竞争性结合呢？采用微量热泳动 (MST) 技术可以解决多个分子间的竞争性结合难题。本文分享两个采用微量热泳动 (MST) 技术测定多个分子间的竞争性结合分析案例。