RocketCell™ 3D iPSC Complete Growth Kit, AOF 无动物源 3D 诱导多能干细胞完全培养试剂盒应用案例

2D 至 3D：案例 1

iPSC 在 VitroGel® STEM 3D 水凝胶中的生长——从 2D 培养体系传代至 3D 培养体系

图 1：RocketCell™ 3D iPSC 完全培养试剂盒（AOF）中人 iPSC 的 3D 扩增

A： 代表性延时显微图像显示，人 iPSC 从单细胞和小细胞聚集体逐渐形成均一的 3D 球体，并在 VitroGel® STEM 水凝胶中持续生长（第 0 天将来源于 2D 培养体系的细胞接种至 3D 水凝胶中）。培养数天后，形成的球体形态均一，直径达到约 85–100 μm。

B： 球体生长的定量分析显示，随着培养时间延长，球体总面积持续增加；培养 6.5 天后，平均扩增接近 300%，表明在无动物源成分培养条件下，该体系能够实现稳定且具有良好重复性的 3D 细胞增殖。

 

 

3D 传代培养：案例 1

采用 VitroGel® STEM 3D 水凝胶培养的 iPSC 进行定量检测

Alamar Blue 活力染料检测  vs  自动细胞计数

图 2：RocketCell™ 3D iPSC 完全培养试剂盒（AOF）中 3D iPSC 生长的定量评估

A： Alamar Blue 吸光度检测结果显示，3D 培养的 iPSC 代谢活性随培养时间逐渐升高，表明细胞具有良好的增殖能力和存活率。

B： 对应的细胞计数结果进一步证实，iPSC 球体在 VitroGel® STEM 水凝胶中持续生长和扩增，表明该试剂盒能够支持持续、稳定的无动物源成分 3D 细胞增殖。

这些结果表明，对于包埋于 VitroGel® STEM 水凝胶中的 iPSC，可以使用 Alamar Blue 等代谢活性检测方法来评估细胞扩增情况，并可与从水凝胶中回收细胞后采用传统细胞计数方法获得的结果进行比较。

结果同时显示，不同 iPSC 细胞系对 3D 培养环境的响应可能存在差异，部分细胞系在 3D 条件下的生长表现优于其他细胞系。总体而言，Alamar Blue 检测与细胞计数所呈现的生长趋势基本一致。

需要注意的是，Alamar Blue 检测存在信号饱和的可能性。例如，在 CD34-eIPS 细胞系中，这种现象在第 11 天相比其他细胞系更加明显。

 

3D 传代培养：案例 2

VitroGel® STEM 3D 水凝胶中培养的荧光标记 iPSC 成像

宽场显微镜  vs  共聚焦显微镜

A                                          B                                            C                                        D

     

图 3：在 RocketCell™ 3D iPSC 完全培养试剂盒（AOF）中培养的 RFP 标记人 iPSC（HFF-1VL-RFP，TheWell Bioscience）成像

将来自 2D 培养体系的 iPSC 按 100,000 个细胞/孔的密度接种于 24 孔 VitroPrime™ 3D 培养及成像板中。培养 7 天后，分别使用 Keyence BZX 系统（A、B）和 Leica MICA 系统（C、D）对培养物进行成像。

Keyence 系统采用宽场照明，并结合 1D 光学切片滤光片（sectioning filter）辅助 3D 成像，可分别在明场（A）和荧光（B）模式下对 iPSC 球体进行 3D 成像。

相比之下，MICA 系统采用传统激光成像技术，能够以更高的细节度进行成像，并生成 3D 模型。

图 D 所显示的成像深度为 500 μm，对应的成像视野约为 800 × 900 μm。

 

3D 传代培养：案例 3

VitroGel® STEM 3D 水凝胶中培养的 iPSC 活细胞表面 EpCAM 免疫染色

（共聚焦显微镜）

图 4：在 RocketCell™ 3D iPSC 完全培养试剂盒（AOF）中培养的人 iPSC（HFF-1VL，TheWell Bioscience）活细胞表面免疫荧光染色

将来自 2D 培养体系的 iPSC 按 100,000 个细胞/孔的密度接种于 24 孔 VitroPrime™ 3D 培养及成像板中。培养 7 天后，去除培养基，并更换为含有稀释 抗 EpCAM-PE-Alexa594 标记抗体的培养基。

于 37°C 孵育 1 小时，随后进行清洗：加入 0.5 mL 生长培养基，每次孵育 5 分钟，共清洗 3 次。

随后使用 Leica MICA 共聚焦显微镜对样品进行成像（A）。渲染后的 3D 图像（B）成像深度为 300 μm，对应的成像视野约为 800 × 900 μm。

 

3D 传代培养：案例 4

VitroGel® STEM 3D 水凝胶中培养的 iPSC 活细胞染色

Calcein AM 与 DAPI 染色

A                                                                                                 B

   

图 5：使用活细胞染料监测 RocketCell™ 3D iPSC 完全培养试剂盒（AOF）中培养的 iPSC（HFF-1VL-RFP，TheWell Bioscience）的细胞状态

将来自 2D 培养体系的 iPSC 按 100,000 个细胞/孔的密度接种于 24 孔 VitroPrime™ 3D 培养及成像板中。

培养 7 天后，去除培养基，并更换为含有稀释 Calcein AM 和 DAPI 的培养基。孵育 30 分钟后，去除染料，并使用生长培养基清洗孔板。随后将培养板放回培养箱中继续孵育 30 分钟，再使用 Leica MICA 共聚焦显微镜进行成像（A、B）。

渲染后的 3D 图像（B）成像深度为 400 μm，拼接后的成像视野约为 1.4 mm × 1.1 mm。

 

3D 传代培养：案例 5

VitroGel® STEM 3D 水凝胶中培养的 iPSC 活死细胞染色

无清洗染色法（No-Wash Protocol）

A                                                                                                     B

    

图 6：使用 Cyto3D® 活死细胞检测试剂盒监测 RocketCell™ 3D iPSC 完全培养试剂盒（AOF）中培养的 iPSC（HFF-1VL，TheWell Bioscience）细胞状态

将来自 2D 培养体系的 iPSC 按 100,000 个细胞/孔的密度接种于 24 孔 VitroPrime™ 3D 培养及成像板中。

培养 7 天后，去除培养基，并更换为含有 1:50 稀释 Cyto3D® 活死细胞检测试剂的培养基。孵育 30 分钟后，使用 Leica MICA 共聚焦显微镜进行成像（A、B）。

渲染后的 3D 图像（B）成像深度为 600 μm，拼接后的成像视野约为 1.4 mm × 1.1 mm。

实验结果还表明，Cyto3D® 检测流程无需任何清洗步骤，因此能够简化并加快用于评估活细胞培养物细胞活力的成像流程。

 

3D 传代培养：案例 6

VitroGel® STEM 水凝胶中培养的 iPSC 间接免疫荧光染色

RocketCell™ iPSC 生长培养基（AOF）可维持 iPSC 的多能性

图 7：在 RocketCell™ 3D iPSC 完全培养试剂盒（AOF）中培养的 iPSC 多能性标志物间接免疫荧光染色

将 iPSC 按 100,000 个细胞/孔的密度接种于 24 孔 VitroPrime™ 3D 培养及成像板中，培养 7 天后进行固定，并使用多能性标志物 Tra-1-60、Lin28 和 Oct4 进行染色。采用分别标记 Alexa Fluor 488、594 和 647 的二抗进行荧光检测。

使用 Leica MICA 共聚焦显微镜采集图像。

结果表明，RocketCell™ 3D iPSC 完全培养试剂盒（AOF）能够提供有利的 3D 微环境，有助于维持 iPSC 的多能性。

 

 

3D 传代培养：案例 7

VitroGel® STEM 水凝胶中培养的 iPSC 直接免疫荧光染色

RocketCell™ iPSC 生长培养基（AOF）可维持 iPSC 的多能性

图 8：在 RocketCell™ 3D iPSC 完全培养试剂盒（AOF）中培养的 iPSC（HFF-1VL，TheWell Bioscience）直接免疫荧光染色

将 iPSC 按 100,000 个细胞/孔的密度接种于 24 孔 VitroPrime™ 3D 培养及成像板中，培养 7 天后进行固定，并使用直接标记的多能性标志物抗体进行染色，包括 Lin28（Alexa Fluor 488）、Podocalyxin（Alexa Fluor 594）和 Nanog（Alexa Fluor 647）。

使用 Leica MICA 共聚焦显微镜采集图像。

结果表明，RocketCell™ 3D iPSC 完全培养试剂盒（AOF）能够提供有利的 3D 培养环境，支持多能干细胞多能性的维持。同时，采用直接标记抗体能够简化基于水凝胶的样品处理流程，从而实现更快速、更高效的样品检测与成像。