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题目：CASC8通过c-Myc-GLUT1轴激活磷酸戊糖途径抑制胰腺导管腺癌中的双硫死亡

英文名：CASC8 activates the pentose phosphate pathway to inhibit disulfidptosis in pancreatic ductal adenocarcinoma though the c-Myc-GLUT1 axis

杂志：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research

影响因子：12.8

发表时间：2025年1月27日

研究背景：胰腺导管腺癌（PDAC）是高度侵袭性的消化道恶性肿瘤，虽仅占所有癌症的3%，却为美国癌症相关死亡的第三大原因。程序性细胞死亡（如铁死亡、坏死性凋亡等）在PDAC应激条件下的发展中起重要作用，而双硫死亡作为一种代谢相关的程序性细胞死亡，在PDAC中的作用及调控机制尚不明确。lncRNA CASC8在PDAC代谢和双硫死亡中的功能及分子机制也有待阐明。

研究思路：通过分析TCGA和GTEx数据库中PDAC样本的基因表达数据，鉴定双硫死亡相关基因（DRGs）和lncRNA（DRLs），构建风险模型并发现CASC8高表达与PDAC不良预后相关；随后通过细胞实验（敲低/过表达CASC8）和动物模型（皮下移植瘤、原位移植瘤）探究其对PDAC细胞增殖、迁移及双硫死亡的影响；结合转录组测序、代谢组测序、RNA免疫沉淀等技术，揭示CASC8通过与c-Myc结合增强其稳定性，激活磷酸戊糖途径，降低NADP⁺/NADPH比值，从而抑制双硫死亡的分子机制。

 

 

研究结果：

1、PDAC中双硫死亡及双硫死亡相关基因的表达模式

先前研究总结了24个双硫死亡相关基因（DRGs），分析TCGA-PAAD和GTEx数据发现，多数DRGs在PDAC中高表达，突变率低，ACTN4、TLN1 CNV扩增最多，CAPZB、NUDFA11 CNV缺失，且有11个基因与PDAC预后相关（图1A-F）。评估PDAC细胞系SLC7A11表达后，选4个高表达细胞系实验，显示葡萄糖饥饿使PI阳性细胞增多，DTT和TCEP可逆转，且细胞出现F-肌动蛋白收缩等变化，提示双硫死亡可能促进PDAC进展（图1G-J）。

 

图1

2、基于双硫死亡相关lncRNA的风险特征在PDAC中的构建

为鉴定双硫死亡相关lncRNA（DRLs），用limma包分析PDAC样本，按|cor|≥0.3且P≤0.001得173个DRLs（图2A）；将TCGA样本分训练和测试组，经相关分析确定5个关键DRLs（含CASC8）建立风险特征（图2B）。GEPIA数据库显示CASC8在PDAC中高表达，与较短OS和DFS相关（图2C-E）；单细胞转录组、FISH及CISH验证其主要定位于肿瘤细胞，且表达高于正常和慢性胰腺炎组织，或为PDAC进展预测指标（图2F-I）。

 

图2

3、CASC8在体外葡萄糖饥饿条件下抑制PDAC细胞的双硫死亡

双硫死亡是代谢应激和葡萄糖饥饿触发的细胞死亡，与蛋白质二硫键形成相关。研究CASC8（双硫死亡相关lncRNA）发现，葡萄糖饥饿下，CASC8敲低使PI阳性死亡细胞显著增加，还原剂可逆转；过表达则减少PI阳性细胞（图3A-G）。荧光染色显示CASC8敲低细胞有F-肌动蛋白收缩等双硫死亡形态（图3H），表明其在调节PDAC细胞双硫死亡中起重要作用。

图3

4、CASC8在体内抑制PDAC双硫死亡

为了研究CASC8在体内对双硫死亡的影响，使用慢病毒短发夹RNA（shRNA）构建体建立了稳定的CASC8敲低PDAC细胞。随后，开发了皮下异种移植肿瘤模型。与对照组的异种移植物相比，五只注射了sh-CASC8细胞的小鼠表现出显著更低的肿瘤负荷（P<0.001）（图4A-C）。值得注意的是，用3mg/kg的BAY-876（一种模拟葡萄糖饥饿的GLUT1抑制剂）处理产生了类似的抗肿瘤效果，表明CASC8与体内葡萄糖代谢之间存在潜在联系（P<0.001）。对石蜡包埋的异种移植肿瘤进行了Ki-67的IHC染色、CASC8的CISH以及TUNEL测定（图4D）。为了验证这些发现，进一步采用了原位异种移植模型，将肿瘤细胞植入小鼠胰腺。与皮下模型的结果一致，阴性对照组的五只小鼠与sh-CASC8组相比，发展出明显更大和更重的肿瘤（P=0.0065）。重要的是，在原位模型中用3mg/kg的BAY-876处理维持了这种观察到的肿瘤大小差异（P<0.001）（图4E-F）。同时，IHC结果还表明对照组比sh-CASC8组具有更强的增殖能力（图4G）。总体而言，这些体内发现强烈表明CASC8可以抑制PDAC细胞中的双硫死亡，可能通过调节葡萄糖代谢。

 

图4

5、CASC8与PDAC细胞中的磷酸戊糖途径相关

为阐明CASC8调控PDAC进展和双硫死亡的机制，对CASC8敲低细胞及对照进行RNA-seq，GO、KEGG和GSEA分析显示对照组基因富集于糖酵解和磷酸戊糖途径（图5A）。qRT-PCR、Western blotting等证实CASC8敲低下调ENO1、GLUT1等，减少GLUT1蛋白（图5B-C）。CASC8敲低还下调磷酸戊糖途径相关基因，增加NADP⁺/NADPH比值，降低葡萄糖摄取，过表达实验结果则相反；代谢组学显示其影响相关代谢物水平，表明CASC8显著影响PDAC细胞的磷酸戊糖途径（图5D-M）。

 

图5

6、CASC8能够结合c-Myc并调节其蛋白稳定性

为阐明CASC8表达增加如何促进磷酸戊糖途径的潜在机制，对TCGA-PAAD数据集进行了GSEA分析。该分析揭示了CASC8表达与c-Myc靶基因表达之间存在显著相关性（图 href="#Fig6">6A）。这一结果通过RNA测序进一步得到证实（图 href="#Fig6">6B）。c-Myc转录因子在调节基本细胞过程中起着关键作用。在肿瘤细胞中，快速增殖和生长通常导致对能量的需求增加。为满足这一需求，肿瘤常表现出c-Myc的过表达或异常激活，进而调节糖酵解和磷酸戊糖途径等葡萄糖代谢途径，为癌细胞提供充足能量。基于这些观察结果，假设CASC8可能与c-Myc蛋白相互作用，可能通过激活下游效应分子来发挥其功能。RNA免疫沉淀（RIP）和共定位实验为这一假设提供了初步支持（图 href="#Fig6">6C-E）。Westernblotting分析进一步揭示，在CASC8敲低后，c-Myc蛋白水平显著降低，而CASC8过表达则导致c-Myc蛋白水平升高，无论是否存在葡萄糖（图 href="#Fig6">6F-I）。为研究蛋白稳定性，用10μg/mL的Cycloheximide（CHX）处理细胞，以抑制蛋白合成六小时。该实验表明，与对照组相比，CASC8敲低细胞的c-Myc降解速率显著增加（图 href="#Fig6">6J-K）。此外，敲低CASC8显著降低了下游c-Myc靶基因的mRNA水平（图 href="#Fig6">6L）。综合这些发现表明，CASC8可以与c-Myc蛋白结合，促进其稳定性，从而激活下游效应分子。

 

图6

7、CASC8通过调节c-Myc在体外促进PDAC生长和迁移

为探究CASC8与c-Myc在胰腺导管腺癌（PDAC）进展中的功能关系，在CASC8敲低细胞中过表达c-Myc，在CASC8过表达细胞中敲低 c-Myc，蛋白质印迹分析验证了操作效力（图 7A-B）。对不同 PDAC细胞组的相对 NADP+/NADPH 比例和葡萄糖摄取研究显示，CASC8敲低细胞中过表达c-Myc可减弱NADP+/NADPH比例的增加，并挽救葡萄糖摄取的减少（图7C-D）；CASC8过表达细胞中敲低c-Myc则效果相反（图7E-F）。葡萄糖饥饿条件下，CASC8敲低细胞中过表达c-Myc显著减少二硫键形成细胞（图7G-I）。这些表明，葡萄糖缺乏时CASC8通过 c-Myc 依赖性机制促进PDAC细胞存活。

 

 

图7

8、CASC8通过c-Myc在体内抑制PDAC二硫键形成

之前体外研究提示CASC8通过c-Myc抑制胰腺导管腺癌（PDAC）的氧化蛋白聚集。为在体内进一步验证c-Myc是CASC8在PDAC氧化蛋白聚集中的关键下游效应因子，采用了皮下异种移植模型。在注射BAY-876后，接种sh-CASC8+c-Myc细胞的五只小鼠肿瘤体积和重量显著增加，与sh-CASC8组相比（图 href="#Fig8">8A-C）。石蜡包埋的异种移植肿瘤进行Ki-67、c-Myc和CISH（CASC8）的免疫组化（IHC）染色，以及TUNEL检测。与sh-CASC8组相比，sh-CASC8+c-Myc组Ki-67阳性细胞比例更高，死亡细胞更少（图 href="#Fig8">8D）。这些结果在原位异种移植模型中得到证实，其中c-Myc过表达导致四只携带CASC8敲低细胞的肿瘤负荷增加（图 href="#Fig8">8E-F）。综合这些体内数据强烈表明，c-Myc作为CASC8调节氧化蛋白聚集的关键下游效应因子。

 

图8

总结：本研究证实胰腺导管腺癌中存在二硫化物应激反应，揭示CASC8高表达与PDAC患者不良预后相关，且CASC8通过与c-Myc结合增强其稳定性，激活戊糖磷酸途径，降低NADP+/NADPH比值，抑制二硫化物应激反应，进而促进PDAC进展。傲星生物深耕生信分析十余载，有丰富的实验方案、完善的下游验证、机制研究服务，一对一专属服务为您排忧解难，助您轻松应对毕业和晋升！