细胞培养常见问题及解决（二）

11. 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除 DMSO？
除少数特别注明对 DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应
直接放入含有 10-15ml 新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO 即可， 如
此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
12. 附着性细胞继代时所使用之 trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？
一般使用之 trypsin-EDTA 浓度为 0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于
无菌试管中， 保存于–20 °C，避免反复冷冻解冻造成 trypsin 之活性降低， 并可减少污染之机会。
13.欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？
欲回收动物细胞， 其离心速率一般为 300xg (约 1,000rpm)，5 - 10 分钟， 过高之转速， 将造成细胞
死亡。
14. 细胞冷冻培养基之成份为何？
动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含 5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和 90 - 95 % 原来
细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于 DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将 DMSO
直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。
15.DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？
冷冻保存使用之 DMSO 等级， 必须为 Tissue culture grade 之 DMSO (如 Sigma D2650)， 其本身即为
无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于 4°C，避免反复冷冻解冻造成 DMSO
之裂解而释出有害物质， 并可减少污染之机会。若要过滤 DMSO， 则须使用耐 DMSO 之 Nylon 材
质滤膜。
16.冷冻保存细胞之方法？
冷冻保存方法一: 冷冻管置于 4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) →
液氮槽 vaporphase 长期储存。
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降 1-3 °C 至–80 °C 以下， 再放入
液氮槽 vapor phase 长期储存。*-20 °C 不可超过 1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦
可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。17. 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？
冷冻管内细胞数目一般为 1x106 cells/ml vial， 融合瘤细胞则以 5x106 cells/ml vial 为宜。
18.培养基中是否须添加抗生素？
除于特殊筛选系统中外， 一般正常培养状态下， 培养基中不应添加任何抗生素。
19.应如何避免细胞污染？
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、
操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细
胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
20.如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？
原则上：直接灭菌后丢弃之。
当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或
酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查 HEPA 过滤器。
高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素
产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素 B 和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推
荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
1.在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。
2.分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到
每一个孔中。例如，两性霉素 B 推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3.每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。
4.确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度 2～3 倍浓度的抗生素的培养液培养细胞 2～3 代。
5.在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
6.重复步骤 4。
7.在无抗生素的培养基中培养 4～6 代，确定污染是否以已被消除。