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技术资料/正文
普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的 基本原理和操作步骤---反向PCR
1166 人阅读发布时间：2022-06-29 15:59
1概述
通常测定一个与已知序列相邻的DNA序列是必要的，例如位于编码DNA的上游和下游两侧的区域，转位因子的插入位点以及克隆于Lambda、科期粒或酵母人工染色体载体上的DNA片段末段的未知序列的探针等。这种末端特异探针在Southern Blot或染色体步移(Chromosome walking)所需的噬菌斑杂交或克隆杂交中都十分有用。为了得到边侧序列的探针，通常采用扩展的PCR方法，使相邻边侧区域得以扩增。
2 PCR与反向PCR的区别
PCR只能扩增两端序列已知的基因片段。如图1所示：
图1 PCR引物扩增方向
图2 反向PCR引物扩增方向
图3 线性DNA的环化
图4 反向PCR扩增
展示空间有限，详见下方技术资料详情↓
通常测定一个与已知序列相邻的DNA序列是必要的，例如位于编码DNA的上游和下游两侧的区域，转位因子的插入位点以及克隆于Lambda、科期粒或酵母人工染色体载体上的DNA片段末段的未知序列的探针等。这种末端特异探针在Southern Blot或染色体步移(Chromosome walking)所需的噬菌斑杂交或克隆杂交中都十分有用。为了得到边侧序列的探针，通常采用扩展的PCR方法，使相邻边侧区域得以扩增。
2 PCR与反向PCR的区别
PCR只能扩增两端序列已知的基因片段。如图1所示：
图1 PCR引物扩增方向
反向PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段。如图2所示：
图2 反向PCR引物扩增方向
3 反向PCR基本原理
反向PCR（Reverse PCR）是常规聚合酶链反应技术的修改和发展，是克隆T-DNA插入位点侧翼DNA序列非常有效的方法。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究。
扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子。如图3所示：
反向PCR（Reverse PCR）是常规聚合酶链反应技术的修改和发展，是克隆T-DNA插入位点侧翼DNA序列非常有效的方法。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究。
扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子。如图3所示：
图3 线性DNA的环化
通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段。如图4所示：
图4 反向PCR扩增
展示空间有限，详见下方技术资料详情↓