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技术资料/正文
普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的 基本原理和操作步骤---原位PCR
638 人阅读发布时间：2022-06-29 16:00
原位PCR
1 概述
自20世纪80年代中期PCR技术诞生以来, 研究人员就一直探索着将PCR技术与形态学研究结合起来。1990年, A.T. Haase等首创了原位PCR(In situ PCR, ISPCR), 当时称为 “细胞内PCR”。原位PCR是原位杂交和PCR结合的产物, 兼有二者的优点, 具有较好的灵敏性与专一性, 可同时获得组织、细胞及染色体的形态结构信息与分子信息, 又能检测出细胞中单拷贝或低拷贝的DNA、RNA序列。
2 原位PCR原理
原位PCR是通过在单细胞或组织切片上对特异DNA(或cDNA)进行PCR扩增, 然后采用原位杂交或免疫组织化学反应、荧光检测等技术进行细胞内特定核酸序列的检出及定位的分子技术。原位PCR技术的待检标本一般先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进行PCR扩增时，各种成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可进入细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，于原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大，或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，从而被保留在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指数极扩增，扩增的产物就很容易被原位杂交技术检查。
3 原位PCR类型
3.1 直接原位PCR
直接原位PCR是使用标记的引物或游离核苷酸进行原位PCR反应, 这种标记分子随后进入扩增产物中, 扩增结果可直接观察而不需要进行原位杂交(图1) 。
优点：
(1)操作简便；
(2)流程短；
(3)省时。
缺点：
(1)易发生引物错配或非特异性退火, 容易出现假阳性;
(2)标记的引物会降低PCR效率。
3.2 间接原位PCR
间接原位PCR是在没有标记物的情况下进行PCR反应, 扩增反应结束后, 再用原位杂交技术来检测扩增的信号(图1)。
优点：可以克服由于DNA修复或引物错配引起的非特异性问题, 成为目前最广泛使用的方案。
缺点：需要进行扩增反应后的洗脱和原位杂交过程, 所需时间相对较长。
图1 直接原位PCR和间接原位PCR
图2 原位反转录PCR
展示空间有限，详见下方技术资料......
自20世纪80年代中期PCR技术诞生以来, 研究人员就一直探索着将PCR技术与形态学研究结合起来。1990年, A.T. Haase等首创了原位PCR(In situ PCR, ISPCR), 当时称为 “细胞内PCR”。原位PCR是原位杂交和PCR结合的产物, 兼有二者的优点, 具有较好的灵敏性与专一性, 可同时获得组织、细胞及染色体的形态结构信息与分子信息, 又能检测出细胞中单拷贝或低拷贝的DNA、RNA序列。
2 原位PCR原理
原位PCR是通过在单细胞或组织切片上对特异DNA(或cDNA)进行PCR扩增, 然后采用原位杂交或免疫组织化学反应、荧光检测等技术进行细胞内特定核酸序列的检出及定位的分子技术。原位PCR技术的待检标本一般先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进行PCR扩增时，各种成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可进入细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，于原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大，或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，从而被保留在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指数极扩增，扩增的产物就很容易被原位杂交技术检查。
3 原位PCR类型
3.1 直接原位PCR
直接原位PCR是使用标记的引物或游离核苷酸进行原位PCR反应, 这种标记分子随后进入扩增产物中, 扩增结果可直接观察而不需要进行原位杂交(图1) 。
优点：
(1)操作简便；
(2)流程短；
(3)省时。
缺点：
(1)易发生引物错配或非特异性退火, 容易出现假阳性;
(2)标记的引物会降低PCR效率。
3.2 间接原位PCR
间接原位PCR是在没有标记物的情况下进行PCR反应, 扩增反应结束后, 再用原位杂交技术来检测扩增的信号(图1)。
优点：可以克服由于DNA修复或引物错配引起的非特异性问题, 成为目前最广泛使用的方案。
缺点：需要进行扩增反应后的洗脱和原位杂交过程, 所需时间相对较长。
图1 直接原位PCR和间接原位PCR
3.3 原位反转录PCR
在原位 PCR 中加上一步反转录过程(RT) , 新形成的cDNA作为模板用于扩增, 这个过程叫做原位反转录PCR( in situ reverse transcription PCR, 简称原位RTPCR)。它又分为直接原位RTPCR和间接原位RTPCR两种(图2)。
原位RT PCR可用来检测细胞或组织中低拷贝的mRNA或特异基因的表达。
Tips：在原位 RTPCR 中, 首先要对组织样品进DNA 酶处理, 以破坏组织细胞中的DNA。
在原位 PCR 中加上一步反转录过程(RT) , 新形成的cDNA作为模板用于扩增, 这个过程叫做原位反转录PCR( in situ reverse transcription PCR, 简称原位RTPCR)。它又分为直接原位RTPCR和间接原位RTPCR两种(图2)。
原位RT PCR可用来检测细胞或组织中低拷贝的mRNA或特异基因的表达。
Tips：在原位 RTPCR 中, 首先要对组织样品进DNA 酶处理, 以破坏组织细胞中的DNA。
图2 原位反转录PCR
展示空间有限，详见下方技术资料......