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技术资料/正文
普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的 基本原理和操作步骤---反转录PCR
1973 人阅读发布时间：2022-06-29 15:58
1概述
反转录-聚合酶链式反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)，也称逆转录PCR，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。其灵敏度比传统的RNA印迹法高1000〜10000倍，而所需时间缩短了几倍。迄今为止，RT-PCR的方法已经广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。
2 RT-PCR原理
RT-PCR是一种从细胞RNA (mRNA)中高效灵敏地扩增cDNA序列的方法，它由两大步骤组成：一步是反转录（RT)，另一步是PCR。获得总RNA或mRNA后，即可进行RT-PCR。首先，在反转录酶作用下将RNA(mRNA)反转录成cDNA，以该cDNA第一链为模板进行PCR扩增，根据靶基因设计用于PCR扩增的基因特异的上下游引物，基因特异的上游引物与cDNA第一链退火，在Taq DNA聚合酶作用下合成cDNA第二链。再以cDNA第一链和第二链为模板，用基因特异的上下游引物PCR扩增获得大量的cDNA。反应原理图如下。
反转录-聚合酶链式反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)，也称逆转录PCR，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。其灵敏度比传统的RNA印迹法高1000〜10000倍，而所需时间缩短了几倍。迄今为止，RT-PCR的方法已经广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。
2 RT-PCR原理
RT-PCR是一种从细胞RNA (mRNA)中高效灵敏地扩增cDNA序列的方法，它由两大步骤组成：一步是反转录（RT)，另一步是PCR。获得总RNA或mRNA后，即可进行RT-PCR。首先，在反转录酶作用下将RNA(mRNA)反转录成cDNA，以该cDNA第一链为模板进行PCR扩增，根据靶基因设计用于PCR扩增的基因特异的上下游引物，基因特异的上游引物与cDNA第一链退火，在Taq DNA聚合酶作用下合成cDNA第二链。再以cDNA第一链和第二链为模板，用基因特异的上下游引物PCR扩增获得大量的cDNA。反应原理图如下。
3 一步法与两步法RT-PCR
常用的反转录PCR方法有两步法（Two-step RT-PCR)和一步法（One-step RT-PCR)两种。两者的区别与特点如下表所示。
常用的反转录PCR方法有两步法（Two-step RT-PCR)和一步法（One-step RT-PCR)两种。两者的区别与特点如下表所示。
4 RT-PCR实验步骤
4.1 RNA的提取
(1) 50-100mg组织或（5~10)×106个细胞，加入1mL Trizol试剂。对组织来说，需要在匀浆器中匀浆几分钟，至组织完全破碎。对培养细胞来说，可用移液器上下吹打或匀浆机破碎细胞。
(2) 4 ℃、12 000g离心10 min,转移上清。
(3) 上清室温放置5min，加0.2mL氯仿，用手或Votex剧振15 s，室温放置2~3min。
(4) 4℃、11 000 g离心15 min,转移水相。
(5) 水相中加入0.25 mL异丙醇及0.25 mL高盐沉淀液（0.8mol/L的柠檬酸钠，1.2mol/L的 NaCl)混匀，室温放置10min。
(6) 4℃、11000 g离心10 min去上清。
(7) 加1 mL75%乙醇，Votex混匀，4℃、7000g离心5min，去上清。
(8) 沉淀在空气中干燥5~10 min,用100 μL DEPC水溶解，枪头吸打几次，放于 55℃水浴中10min促溶。
(9) 电泳及检测OD值，检定RNA的量及完整性。
(10) RNA放入-70℃保存。
4.2 mRNA的分离
(1) 检测起始RNA的量（起始RNA的量应小于或等于0.25mg）。将总RNA加入一个无RNase的1.5 mL Eppendorf管中，加入不含RNase的水至总体积为250 μL。
(2) 加入250μL的Buffer OBB和15μL的Oligotex悬浮液，完全混合溶液。
(3) 样品溶液放入70℃水浴中保温3 min。
(4) 从水浴中取出样品溶液，室温下放置10min。（这一步允许Oligotex粒子中的Oligo-dT30 和mRNA的poly-A尾巴杂交）
(5) 将样品溶液以最大速度（14000~18000 g)离心2min以沉淀Oligotex-mRNA 复合物，用移液器小心除去上清液。
(6) 用涡旋振荡器（Votex)或移液器将Oligotex-mRNA复合物沉淀重悬于400 μL或600 μL Buffer OW2中，然后将这些悬液加入到一个置于1. 5 mL微量离心管中的小离心柱（用于400 μL悬液）或大离心柱（用于600 μL悬液）中，以最大速度离心1 min。
(7) 转移离心柱到一个新的不含RNA酶的1.5 mL微量离心管中，然后加入400 μL或600 μL Buffer OW2到离心柱中，以最大速度离心1 min，并且弃掉离心液。
(8) 转移离心柱到一个新的不含RNA酶的1.5mL微量离心管中，加入 20-100 μL Buffer OEB (70℃预热）到柱子中，用移液器洗打溶液3~4次以重悬柱子上的Oligotex-mRNA复合物，以最大速度离心1 min。
(9) 为了获得最大的产量，再加入20-100 μL Bulfer OEB (70℃预热）到柱子中，然后用同样的方法重悬柱子中的Oligotex-mRNA复合物，以最大速度离心1min。为了减少洗脱体积，可以将第一次洗脱液重新加热到70℃后再用来进行另一次洗脱。但是如果要获得最大量的mRNA，则建议还是用新的Buffer OEB来洗脱。
4.3 RT-PCR
(1) 按下列组成配制RT-PCR反应液。
4.1 RNA的提取
(1) 50-100mg组织或（5~10)×106个细胞，加入1mL Trizol试剂。对组织来说，需要在匀浆器中匀浆几分钟，至组织完全破碎。对培养细胞来说，可用移液器上下吹打或匀浆机破碎细胞。
(2) 4 ℃、12 000g离心10 min,转移上清。
(3) 上清室温放置5min，加0.2mL氯仿，用手或Votex剧振15 s，室温放置2~3min。
(4) 4℃、11 000 g离心15 min,转移水相。
(5) 水相中加入0.25 mL异丙醇及0.25 mL高盐沉淀液（0.8mol/L的柠檬酸钠，1.2mol/L的 NaCl)混匀，室温放置10min。
(6) 4℃、11000 g离心10 min去上清。
(7) 加1 mL75%乙醇，Votex混匀，4℃、7000g离心5min，去上清。
(8) 沉淀在空气中干燥5~10 min,用100 μL DEPC水溶解，枪头吸打几次，放于 55℃水浴中10min促溶。
(9) 电泳及检测OD值，检定RNA的量及完整性。
(10) RNA放入-70℃保存。
4.2 mRNA的分离
(1) 检测起始RNA的量（起始RNA的量应小于或等于0.25mg）。将总RNA加入一个无RNase的1.5 mL Eppendorf管中，加入不含RNase的水至总体积为250 μL。
(2) 加入250μL的Buffer OBB和15μL的Oligotex悬浮液，完全混合溶液。
(3) 样品溶液放入70℃水浴中保温3 min。
(4) 从水浴中取出样品溶液，室温下放置10min。（这一步允许Oligotex粒子中的Oligo-dT30 和mRNA的poly-A尾巴杂交）
(5) 将样品溶液以最大速度（14000~18000 g)离心2min以沉淀Oligotex-mRNA 复合物，用移液器小心除去上清液。
(6) 用涡旋振荡器（Votex)或移液器将Oligotex-mRNA复合物沉淀重悬于400 μL或600 μL Buffer OW2中，然后将这些悬液加入到一个置于1. 5 mL微量离心管中的小离心柱（用于400 μL悬液）或大离心柱（用于600 μL悬液）中，以最大速度离心1 min。
(7) 转移离心柱到一个新的不含RNA酶的1.5 mL微量离心管中，然后加入400 μL或600 μL Buffer OW2到离心柱中，以最大速度离心1 min，并且弃掉离心液。
(8) 转移离心柱到一个新的不含RNA酶的1.5mL微量离心管中，加入 20-100 μL Buffer OEB (70℃预热）到柱子中，用移液器洗打溶液3~4次以重悬柱子上的Oligotex-mRNA复合物，以最大速度离心1 min。
(9) 为了获得最大的产量，再加入20-100 μL Bulfer OEB (70℃预热）到柱子中，然后用同样的方法重悬柱子中的Oligotex-mRNA复合物，以最大速度离心1min。为了减少洗脱体积，可以将第一次洗脱液重新加热到70℃后再用来进行另一次洗脱。但是如果要获得最大量的mRNA，则建议还是用新的Buffer OEB来洗脱。
4.3 RT-PCR
(1) 按下列组成配制RT-PCR反应液。
(2)以下条件进行RT-PCR反应。