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技术资料/正文
普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的 基本原理和操作步骤---普通PCR
2828 人阅读发布时间：2022-06-29 16:00
普通PCR
1概述聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，缩写：PCR，又称多聚酶链式反应)，是一项利用DNA双链复制的原理，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。透过这项技术，可在短时间内大量扩增目的基因，而不必依赖大肠杆菌或酵母菌等生物体。
2 PCR原理
PCR技术的基本原理首先基于DNA半保留复制原理，还有碱基互补配对原则，即复制的过程中双链DNA会解链，由双链变成单链，温度一般为95℃；之后温度降下来，引物会结合到DNA单链上，在DNA聚合酶的作用下，把游离的dNTP按照碱基互补配对原则结合到单链上，形成一条由旧链和新链杂合成的新的双链DNA。这个过程可概括为‘变性-退火-延伸’三个基本步骤。
图1 PCR反应简图
一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成，每个循环包括以下3个步骤：
变性：利用高温（94℃～98℃）使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前，通常加热长一些时间以确保模板和引物完全分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1～2分钟，接下来机器就控制温度进入循环阶段。
退火（又称复性、降温贴合、缓冷配对、引物黏合）：在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1～2分钟。新技术的融合型核酸聚合酶在此阶段的温度会高于熔点3~5℃，仅需时间5~10秒。
延伸：DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000 bp大概需要1分钟、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。有修正功能的则会比较慢。
3 PCR反应体系
变性：利用高温（94℃～98℃）使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前，通常加热长一些时间以确保模板和引物完全分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1～2分钟，接下来机器就控制温度进入循环阶段。
退火（又称复性、降温贴合、缓冷配对、引物黏合）：在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1～2分钟。新技术的融合型核酸聚合酶在此阶段的温度会高于熔点3~5℃，仅需时间5~10秒。
延伸：DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000 bp大概需要1分钟、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。有修正功能的则会比较慢。
3 PCR反应体系
表1 标准的PCR反应体系
| 组分 | 用量 |
| 10×扩增缓冲液 | 10μl |
| 4种dNTP混合物 | 200μl |
| 引物 | 10～100μl |
| 模板DNA | 0.1～2μg |
| Taq DNA聚合酶 | 2.5 μl |
| Mg2+ | 1.5mmol/L |
| 加双蒸水 | 100 μl |