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PCR反应过程及反应体系成份综述
人阅读 发布时间：2024-03-15 14:00
PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶链式反应，PCR原理DNA双链复制，DNA双链结构高温氢键断裂。目的是在生物体外大量扩增特定DNA片段的分子生物学技术，其特点是可以以微量的DNA为模板，快速扩增得到大量拷贝。其基本过程，首先将待扩增的模板DNA变性使之成为单链，DNA样品中，特异性的引物能够与其互补的序列杂交，在dNTPs和Taq酶存在时，就可以合成模板DNA的互补链，反应完成后，将反应混合物加热使DNA双链变性，温度下降后，过量的引物又可以开始第二轮的合成反应。这种延伸-变性-退火-延伸的循环可以重复多次，使所需要的DNA片段得到特异性的扩增。
PCR反应过程：
1、变性：利用高温（93-98℃）使双链DNA解螺旋，高温使两条DNA链间的氢键断裂。在第一个循环之前，通常加热时间较长以确保模板DNA完全分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟，接下来机器就控制温度进入循环阶段。
2、退火：将反应温度降低至50-65℃（通常比引物 值低3-5℃）持续20-40s，从而使引物结合于单链DNA上。若退火温度过低，容易造成非特异扩增，而退火温度过高，引物可能根本不结合。
3、延伸：此步骤的温度取决于所用的DNA聚合酶。 Taq（Thermus aquaticus）聚合酶的热稳定DNA聚合酶的最佳活性温度约为75–80°C，但通常使用的延伸温度为72°C。 在这一步骤中，DNA聚合酶通过从反应体系中添加的5'至3'方向的游离dNTP，从而合成与DNA模板链互补的新DNA链。延伸所需的精确时间取决于所用的DNA聚合酶和待扩增的DNA片段的长度。 传统的Taq 酶估计合成1000bp大概需要1分钟、较新的Tbr 酶（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40s、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15s。有修正功能的则会比较慢。
上述循环结束后，将进入终延伸阶段：此步骤是可选的，但要在70-74°C）（PCR中使用的大多数聚合酶最佳活性所需的温度范围）下进行5-15分钟。
4、循环：
以确保所有剩余的单链DNA的冈崎片段被补齐。
最终保持：最后一步将PCR仪反应室无限期地冷却至4–15°C，可用于PCR产物的短期保存。
PCR反应体系由反应缓冲液（PCR Buffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTP mix）、Taq DNA聚合酶（Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、 Mg2+、靶序列（DNA模板）主要成份组成。各个组份对PCR结果至关重要。
1、 反应缓冲液（PCR Buffer）
（1）、反应缓冲液一般含10-50 mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8)， 50 mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+ 。Tris·Cl在20℃时pH为8.3-8.8，但在实际PCR反应中，pH为6.8-7.8. 50 mmol/L的KCl有利于引物的退火。
（2）、反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100 μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它们可稳定酶活性，另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利。
（3）、各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。
2、 脱氧核苷三磷酸底物（dNTP mix）
dNTP包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP。dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。多次冻融会使dNTP降解。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。当PCR需要较高浓度的dNTP时，应在反应体系中适当增加Mg2+的浓度。
（1）dNTP应用NaOH 将pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。
（2）dNTP原液可配成5-10 mmol/L并分装，-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200 μmol/L。
（3）理论上4 种 dNTP各20 μmol/L，足以在100 μl反应中合成2.6 μg的DNA。当dNTP终浓度大于50 mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。
3、 Taq DNA聚合酶（Taq 酶）
一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130 min，95℃ 40 min， 97℃ 5 min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。
Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30 min，掺入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般PCR中出错率为2×10-4 核苷酸/每轮循环，在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意.在100 μl PCR反应中，1.5-2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环。
所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。
反应结束后，如果需要利用这些产物进行下一步实验，需要预先灭活Taq DNA聚合酶， 灭活Taq DNA聚合酶的方法有：
（1）PCR产物经酚: 抽提，乙醇沉淀。
（2）加入10 mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。
（3） 99-100℃加热10 min。目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。
4、 寡聚核苷酸引物
PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：
（1） 引物长度约为16-30 bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。
（2）引物中G+C含量通常为40%-60%，可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝4(G+C)+2(A+T)。
（3）四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误引发。
（4）引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应， 以减少由于密码子摆动产生的不配对。
（5）在引物内， 尤其在3'端应不存在二级结构。
（6）两引物之间尤其在3'端不能互补， 以防出现引物二聚体， 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。
（7）引物5'端对扩增特异性影响不大， 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素等。通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。
（8）引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构， 以免产生非特异性扩增，影响产量。
（9）简并引物应选用简并程度低的密码子， 例如选用只有一种密码子的Met， 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
（10）一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0 μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体， 过低则降低产量。利用紫外分光光度计， 可精确计算引物浓度， 在1cm光程比色杯中，260nm下，引物浓度可按下式计算：
X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X： 引物摩尔浓度，A、C、G、T：引物中4种不同碱基个数。
5、 Mg2+
（1）Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度， 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。
（2）通常Mg2+ 浓度范围为0.5-2 mmol/L.对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5 mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。
（3）在PCR反应混合物中， 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团， 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+ 离子浓度的物质，以保证最适Mg2+ 浓度。
6、 靶序列（DNA模板）
（1）PCR反应必须以DNA为模板进行扩增， 模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。
（2）就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102 -105 个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时，用量更少。
（3）灵敏的PCR可从一个细胞，一根头发，一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。
（4）模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。
注意事项：
1.PCR应该在没有DNA污染的干净环境中进行，最好设立一个专用的PCR配制室、模板室、扩增室，避免污染（16S）。
2.纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
3.所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染，操作过程中均应戴手套。
4.PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高温高压灭菌。5.试剂都应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性与平行性。
6.试剂或样品准备过程中都要使用灭菌的tubes和tips，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
7.PCR配制试剂应在冰上融化，并且要瞬离并充分混匀。
PCR反应过程：
1、变性：利用高温（93-98℃）使双链DNA解螺旋，高温使两条DNA链间的氢键断裂。在第一个循环之前，通常加热时间较长以确保模板DNA完全分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟，接下来机器就控制温度进入循环阶段。
2、退火：将反应温度降低至50-65℃（通常比引物 值低3-5℃）持续20-40s，从而使引物结合于单链DNA上。若退火温度过低，容易造成非特异扩增，而退火温度过高，引物可能根本不结合。
3、延伸：此步骤的温度取决于所用的DNA聚合酶。 Taq（Thermus aquaticus）聚合酶的热稳定DNA聚合酶的最佳活性温度约为75–80°C，但通常使用的延伸温度为72°C。 在这一步骤中，DNA聚合酶通过从反应体系中添加的5'至3'方向的游离dNTP，从而合成与DNA模板链互补的新DNA链。延伸所需的精确时间取决于所用的DNA聚合酶和待扩增的DNA片段的长度。 传统的Taq 酶估计合成1000bp大概需要1分钟、较新的Tbr 酶（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40s、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15s。有修正功能的则会比较慢。
上述循环结束后，将进入终延伸阶段：此步骤是可选的，但要在70-74°C）（PCR中使用的大多数聚合酶最佳活性所需的温度范围）下进行5-15分钟。
4、循环：
以确保所有剩余的单链DNA的冈崎片段被补齐。
最终保持：最后一步将PCR仪反应室无限期地冷却至4–15°C，可用于PCR产物的短期保存。
PCR反应体系由反应缓冲液（PCR Buffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTP mix）、Taq DNA聚合酶（Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、 Mg2+、靶序列（DNA模板）主要成份组成。各个组份对PCR结果至关重要。
1、 反应缓冲液（PCR Buffer）
（1）、反应缓冲液一般含10-50 mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8)， 50 mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+ 。Tris·Cl在20℃时pH为8.3-8.8，但在实际PCR反应中，pH为6.8-7.8. 50 mmol/L的KCl有利于引物的退火。
（2）、反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100 μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它们可稳定酶活性，另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利。
（3）、各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。
2、 脱氧核苷三磷酸底物（dNTP mix）
dNTP包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP。dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。多次冻融会使dNTP降解。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。当PCR需要较高浓度的dNTP时，应在反应体系中适当增加Mg2+的浓度。
（1）dNTP应用NaOH 将pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。
（2）dNTP原液可配成5-10 mmol/L并分装，-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200 μmol/L。
（3）理论上4 种 dNTP各20 μmol/L，足以在100 μl反应中合成2.6 μg的DNA。当dNTP终浓度大于50 mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。
3、 Taq DNA聚合酶（Taq 酶）
一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130 min，95℃ 40 min， 97℃ 5 min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。
Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30 min，掺入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般PCR中出错率为2×10-4 核苷酸/每轮循环，在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意.在100 μl PCR反应中，1.5-2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环。
所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。
反应结束后，如果需要利用这些产物进行下一步实验，需要预先灭活Taq DNA聚合酶， 灭活Taq DNA聚合酶的方法有：
（1）PCR产物经酚: 抽提，乙醇沉淀。
（2）加入10 mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。
（3） 99-100℃加热10 min。目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。
4、 寡聚核苷酸引物
PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：
（1） 引物长度约为16-30 bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。
（2）引物中G+C含量通常为40%-60%，可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝4(G+C)+2(A+T)。
（3）四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误引发。
（4）引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应， 以减少由于密码子摆动产生的不配对。
（5）在引物内， 尤其在3'端应不存在二级结构。
（6）两引物之间尤其在3'端不能互补， 以防出现引物二聚体， 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。
（7）引物5'端对扩增特异性影响不大， 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素等。通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。
（8）引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构， 以免产生非特异性扩增，影响产量。
（9）简并引物应选用简并程度低的密码子， 例如选用只有一种密码子的Met， 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
（10）一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0 μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体， 过低则降低产量。利用紫外分光光度计， 可精确计算引物浓度， 在1cm光程比色杯中，260nm下，引物浓度可按下式计算：
X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X： 引物摩尔浓度，A、C、G、T：引物中4种不同碱基个数。
5、 Mg2+
（1）Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度， 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。
（2）通常Mg2+ 浓度范围为0.5-2 mmol/L.对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5 mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。
（3）在PCR反应混合物中， 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团， 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+ 离子浓度的物质，以保证最适Mg2+ 浓度。
6、 靶序列（DNA模板）
（1）PCR反应必须以DNA为模板进行扩增， 模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。
（2）就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102 -105 个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时，用量更少。
（3）灵敏的PCR可从一个细胞，一根头发，一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。
（4）模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。
注意事项：
1.PCR应该在没有DNA污染的干净环境中进行，最好设立一个专用的PCR配制室、模板室、扩增室，避免污染（16S）。
2.纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
3.所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染，操作过程中均应戴手套。
4.PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高温高压灭菌。5.试剂都应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性与平行性。
6.试剂或样品准备过程中都要使用灭菌的tubes和tips，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
7.PCR配制试剂应在冰上融化，并且要瞬离并充分混匀。
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