Tissue Cytometry技术揭示HLA-DR⁺肿瘤细胞导致病毒性肝癌微环境免疫耗竭的作用机制

肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，乙型肝炎病毒（HBV）是其主要致病因素。尽管病毒感染在塑造肿瘤微环境（TME）中起关键作用，但 HBV、丙型肝炎病毒（HCV）和非 B 非 C 型（NBNC）相关 HCC 之间的机制差异仍知之甚少。

 

2025年2月17日，河南省人民医院，郑州大学人民医院及新乡医学院的研究人员在ADVANCED SCIENCE上联合发表题为：HLA-DR+ Tumor Cells Show an Association with a Distinct Immune Microenvironment and CD8+ T-Cell Exhaustion in HBV-Associated Hepatocellular Carcinoma的研究论文，本研究详细描述了 HBV⁺HCC 的 TME，重点关注 HLA-DR⁺肿瘤细胞在促进免疫抑制中的作用。通过整合转录组学、空间和临床分析，揭示了免疫逃逸的新机制，并强调了 HLA-DR⁺肿瘤细胞作为治疗靶点和预后标志物的潜力。

这些发现强调了 HCC 中病因特异性治疗策略的必要性，并强调了理解肿瘤 - 免疫相互作用在开发有效免疫治疗中的重要性。该研究为改善 HCC 患者，特别是 HBV⁺HCC 患者的预后的未来研究奠定了基础。

实验部分

1.应用TissueFAXS Spectra扫描系统：

对 198 例肝癌样本的石蜡包埋组织微阵列（TMAs）进行 mIF 染色，使用 Anti - CD8、Anti - CTLA - 4、Anti - GZMB、Anti - PD - L1、Anti - HLA - DR、Anti - PanCK 等多种抗体标记细胞和分子，染色后利用TissueFAXS Spectra进行高分辨率扫描。以 20× magnification 对染色玻片进行扫描，在 420 至 720 nm 波长区间以 20 nm 间隔捕获荧光光谱，且保持相同曝光时间，从而获取高质量的多色图像数据，为后续分析提供基础。

 

 

2.应用StrataQuest分析软件：用于图像的光谱分解和定量分析。基于扫描得到的光谱数据，该软件能够建立光谱库，对多重荧光图像进行分解，完美解决了多重染色中的串色问题，可以得到每一通道的纯净信号，准确识别和区分不同荧光标记的细胞。

同时，计算目标细胞间的距离以及不同表型细胞间的相互邻居数量（最大距离25um），并分析 CD8 + 细胞亚群（如 CD8+CTLA4 + 和 CD8+GZMB + 细胞）与 PanCK+HLA-DR + 肿瘤细胞的空间距离分布。

 

 

 

图 1. 乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）和非 B 非 C 型（NBNC）相关肝细胞癌（HCC）免疫微环境的特征分析

（D）箱线图比较 HBV、HCV 和 NBNC 患者组间各细胞亚群的频率。使用双侧 Wilcoxon 秩和检验进行两两统计比较，“ns” 表示无显著性。

（E）HBV+（左）、HCV+（中）和 NBNC（右）肿瘤组织微阵列的代表性多重免疫荧光（mIF）图像。PanCK（青色）标记上皮肿瘤细胞，CD8（绿色）标记细胞毒性 T 细胞，DAPI（蓝色）染色细胞核。插图显示放大的肿瘤 - 免疫界面。

（F）从 mIF 数据中量化 PanCK + 肿瘤细胞和 CD8+ T 细胞群体。散点图显示 HBV、HCV 和 NBNC 肿瘤的细胞群比例，百分比反映各组中的细胞分布。

 

该实验部分应用TissueFAXS Spectra扫描系统和StrataQuest分析软件探究免疫细胞与肿瘤细胞的空间关系：在图 1（F）中，通过对 mIF 数据的量化，展示了 HBV、HCV 和 NBNC 肿瘤中 PanCK + 肿瘤细胞和 CD8+ T 细胞群体的比例，反映出不同组间细胞分布的差异。HBV 相关肝癌（HBV+HCC）中 CD8+ T 细胞比例高于 HCV + 和 NBNC 组，NBNC 组肿瘤细胞纯度更高；HLA - DR + 肿瘤细胞可招募 CD8+ T 细胞，但使这些 T 细胞更易表达 CTLA4，而 GZMB 表达减少，诱导 T 细胞耗竭，从而促进免疫抑制微环境形成。分析 HLA - DR、PD - L1 等蛋白的表达水平，确定它们与免疫抑制微环境形成的关联，研究 HLA - DR + 肿瘤细胞对 CD8+ T 细胞功能表型的影响。

 

 

 

图 2. 与丙型肝炎病毒（HCV）和非 B 非 C 型（NBNC）相比，乙型肝炎病毒（HBV）相关肿瘤中 HLA-DR 表达增强

（E）HBV（左）、HCV（中）和 NBNC（右）患者代表性组织微阵列核心的多重免疫荧光（mIF）图像。图中展示 H&E 染色和荧光通道合并图：DAPI（细胞核，蓝色）、PanCK（肿瘤标志物，青色）、CD8（绿色）和 HLA-DR（黄色）。插图突出显示含有 HLA-DR + 肿瘤细胞的肿瘤区域。（F）量化 HBV、HCV 和 NBNC 组中 HLA-DR+PanCK + 肿瘤细胞占总 PanCK + 细胞的比例。使用 Wilcoxon 秩和检验进行两两比较，精确 P 值标注于图上方。（G）scRNA-seq 比较 HLA-DR + 与 HLA-DR−肿瘤细胞的火山图。HLA-DR + 细胞中显著富集的基因（如 HLA-DRA、HLA-DRB1、KRT13）以红色显示；x 轴为细胞分数差异（diff_pct），y 轴为 - log10 校正 P 值。（H）箱线图量化 HBV、HCV 和 NBNC 队列中 PD-L1+HLA-DR+PanCK + 肿瘤细胞。使用 Wilcoxon 秩和检验进行统计比较，标注 P 值。（I）高倍镜 mIF 图像显示 HLA-DR（黄色）与 PD-L1（品红色）在 PanCK + 肿瘤细胞（青色）内共定位。DAPI（蓝色）标记细胞核，白色箭头指示 HLA-DR+PD-L1 + 双阳性肿瘤细胞，突显通过抗原呈递和检查点信号传导实现免疫逃逸的潜力。

 

该实验部分应用StrataQuest分析软件揭露蛋白表达水平：依据荧光信号强度等信息，分析得出不同样本中 HLA - DR、PD - L1 等蛋白的表达水平数据。在图 2（F）中，量化了 HBV、HCV 和 NBNC 组中 HLA - DR+PanCK + 肿瘤细胞占总 PanCK + 细胞的比例；图 2（H）箱线图量化了 PD - L1+HLA - DR+PanCK + 肿瘤细胞在不同队列中的情况，反映出不同病因组和不同蛋白表达之间的关系。

应用TissueFAXS Spectra扫描系统进行蛋白共定位成像：通过对 mIF 图像的分析，确定 HLA - DR 与 PD - L1 等蛋白在肿瘤细胞内的共定位情况，如在图 2（I）高倍镜 mIF 图像下，显示 HLA - DR（黄色）与 PD - L1（品红色）在 PanCK + 肿瘤细胞（青色）内共定位，白色箭头指示 HLA - DR+PD - L1 + 双阳性肿瘤细胞，为研究免疫逃逸机制提供依据。

 

 

图 4. HLA-DR + 肿瘤细胞对肿瘤微环境和 CD8+ T 细胞动态的影响

 

（D）条形图量化高、低 HLA-DR 肿瘤中 CD8+ T 细胞的功能状态，包括初始态、T 细胞受体（TCR）信号、干扰素反应、细胞毒性、激活、耗竭和衰老。Wilcoxon 秩和检验显示高 HLA-DR 组中激活、耗竭和细胞毒性特征显著增强（**** p<0.0001）。

 

（J）箱线图比较乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）和非 B 非 C 型（NBNC）组中 CD8+ T 细胞与 HLA-DR + 肿瘤细胞的空间距离。病毒病因组间无显著差异，提示仅 proximity 不能完全解释功能差异。两两比较采用 Wilcoxon 秩和检验。

（K-M）散点图显示 CD8+ T 细胞功能表型（CD8+、GZMB+、CTLA4+）与距 HLA-DR + 肿瘤细胞距离的关系。更短距离与更高 CTLA4 表达和更低 GZMB 表达相关，表明空间关联的免疫耗竭。

 

该实验部分应用StrataQuest软件测量 CD8+ T 细胞亚群（如 CD8+GZMB + 和 CD8+CTLA4 + 细胞）与 PanCK+HLA - DR + 肿瘤细胞之间的距离，得到细胞间的空间距离数据。在图 4（J）中，通过箱线图比较了 HBV、HCV 和 NBNC 组中 CD8+ T 细胞与 HLA - DR + 肿瘤细胞的空间距离，探究不同病因组间的差异；图 4（K - M）的散点图则展示了 CD8+ T 细胞功能表型（CD8+、GZMB+、CTLA4+）与距 HLA - DR + 肿瘤细胞距离的关系，揭示空间关联的免疫耗竭现象。