基因敲除方法_技术_原理
2062 人阅读发布时间:2021-08-13 10:10
基因敲除的方法
1 经典的同源重组敲除技术
细胞染色体DNA能够和外源DNA发生重组,用设计的同源片段替代靶基因片段,可达到基因敲除的目的。
主要步骤如下:
构建基因敲除重组载体
↓
重组DNA导入受体细胞
↓
筛选成功重组的细胞
↓
后续检测
经典同源重组基因敲除的主要缺点
(1)速度慢,效率低(DNA的同源重组频率一般只有10-6左右):加长两端的同源序列有助于重组,但加大了构建基因敲除载体的难度。该技术主要通过大量培养来增加获得敲除转化子的概率。
(2)载体转化和表达比较关键,周期较长,对细胞感受态要求也较高。
(3)对于真核生物的同源重组基因敲除研究较少:真核生物转化不容易,表达周期长,基因调控复杂,敲除之后不一定出现特定表型。
2 在同源重组基础上发展起来的一些新技术
(1)Red同源重组系统
Red同源重组系统主要包含3种蛋白质分子,分别称为Exo、Beta和Gam,这三者是λ噬菌体中的高效重组蛋白质。其中Exo蛋白是一种核酸外切酶,结合在双链DNA的末端,从5'端向3'端降解DNA,产生3'突出端;Beta蛋白结合在单链DNA上,介导互补单链DNA退火,Gam蛋白可与RecBCD酶结合,抑制其降解外源DNA的活性。