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自营
AtaGenix
抗体/试剂/技术服务/细胞库 / 细胞培养
已认证品牌介绍
普健生物(武汉)科技有限公司由中法科学家于2011年联合成立于武汉，作为ProteoGenix在中国的研发生产基地，总面积4700平方米，其中GMP级别细胞房800平方米，配置一个100平方米的无菌、无内毒素纯化实验室;仪器设备投入逾2000万。作为武汉国家生物产业基地指定的光谷抗体发现与筛选公共服务平台，普健生物具备领先的技术实力和国际化发展的战略格局，专注于重组蛋白、抗体、诊断原料、抗体药物发现等自主技术平台的建设和下游生物医药产品的战略合作。公司立足于生命科学领域，自主建立生命科学研究平台、诊断原料开发平台、抗体药物研发平台，三大完善的技术服务平台：生命科学平台：拥有五大成熟高效的蛋白表达系统(哺乳动物细胞、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、昆虫细胞)，可提供蛋白表达、分子构建-蛋白表达纯化-结构解析、抗体重组表达、鼠/兔单克隆抗体制备以及相关检测服务；诊断原料开发平台：拥有开放式全自动化学发光平台，可缩短研发周期、降低开发成本与技术风险，为广大客户提供各种诊断核心原料开发；抗体药物发现平台以single B细胞抗体发现技术，杂交瘤筛选与噬菌体展示技术为主，目前已完成构建并对外提供抗体筛选技术服务的文库有：新冠特异性抗体噬菌体文库、羊驼天然纳米抗体噬菌体文库、兔源天然抗体噬菌体文库、小鼠天然抗体噬菌体文库、另外可为客户提供鼠/兔/鸡/猪/猫/狗等物种免疫噬菌体抗体文库构建及筛选服务。
自营
ProteoGenix
抗体/试剂/技术服务
已认证品牌介绍
ProteoGenix成立于2003年，致力于开发诊断试剂和生物治疗药物，以靶向其创始人发现的关键蛋白质。ProteoGenix的管理团队迅速认识到高质量抗体和蛋白质对于生物制药产品开发的重要性，并认识到它们在进入临床应用中的巨大潜力。ProteoGenix开发的生物分子的独特特性，使其能够成功克服进入临床应用过程中的诸多挑战。凭借在治疗性抗体和定制试剂方面的深厚经验，ProteoGenix迅速在生命科学领域建立了声誉。作为主要的合同研究组织(CRO)和生物制药领域的可信赖合作伙伴，ProteoGenix在显著提升生物分子进入IND申请的成功率方面取得了卓越成就。作为服务集成商，ProteoGenix全程引导客户从早期发现到临床应用。ProteoGenix的核心目标是从一开始就洞察生物分子的未来需求，并据此制定科学的开发策略。ProteoGenix提供广泛的创新解决方案和技术，依托超过15年的行业经验和稳固的国际地位，ProteoGenix在以下六大服务领域提供独特且定制化的服务：l 抗体工程(人源化、双特异性抗体、ADC、亲和力成熟、分子优化)生物工艺开发(无知识产权限制的稳定细胞系开发、发酵及生物反应器生产优化)单克隆和多克隆抗体开发(杂交瘤法和噬菌体展示)重组蛋白和抗体生产(大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞)基因合成肽合成ProteoGenix的研发实验室始终以创新为导向，通过不断优化技术流程，例如XtenCHOTM，一种瞬时表达细胞系，其生产效率超过了业界标杆ExpiCHO。此外，ProteoGenix还拥有一个包含超过20万种产品的广泛产品目录。产品涵盖抗体、蛋白质、ELISA试剂盒、细胞分离介质、核酸纯化试剂盒等，满足生命科学领域多样化的需求。
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技术资料/正文
GST融合蛋白纯化操作指南
341 人阅读发布时间：2021-08-13 10:04
在蛋白研究中，想获得可溶性蛋白，我们会优先考虑GST融合蛋白表达系统。
谷胱甘肽巯基转移酶(GST)是体内生物转化最重要的Ⅱ相代谢酶之一，是细胞抗损伤、抗癌变的主要解毒系统。GST是一个含有211个氨基酸的蛋白，通常将该蛋白加入到重组蛋白的末端以便对该重组蛋白进行纯化或检测。具有组氨酸的非融合蛋白会产生非特异性结合，这会阻碍组氨酸标签的亲和纯化。但GST标签则与之不同，由于GST对于其底物-谷胱甘肽具有极高的特异性，所以可以获得更高的纯度。
优点：增加外源蛋白的可溶性；适用范围广；可用不同的蛋白酶方便去除；高特异性，纯化方便且温和；提高外源蛋白的稳定性；保留了蛋白的抗原性和生物活性。
缺点：分子量较大，可能会影响蛋白的功能和下游实验，纯化后需要去标签；如果蛋白表达为包涵体，无法直接用GST标签纯化，可变复性后再进行纯化。
GST标签蛋白纯化操作中需要的几种Buffer：
Lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10% Glycerol;
Equilibration/Wash buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0;
Elution buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 15 mM Reduced Glutathione；
Regeneration buffer #1: 500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 8.5, 0.1% SDS;
Regeneration buffer #2: 500 mM NaCl, 100 mM NaOAc pH 4.5, 0.1% SDS.
注意：可直接称取Reduced Glutathione粉末溶解在Equilibration/Wash buffer中，但是溶解后加NaOH将pH调至8.0。
GST标签蛋白纯化操作流程：
1． 依据表达测试蛋白表达量选择合适体积的Glutathione Agarose (载量: 50 mg/ml)，用10 CV纯水将储存液中的酒精洗净，再用10 CV Equilibration buffer平衡；
2． 将平衡好的Glutathione Agarose加入已过滤的细胞裂解液中，4℃（或室温）孵育至少1小时；
3． 孵育后将裂解液加入亲和层析柱中，收集flow through，也可选择700 g，离心2 min，缓慢倒出上清液；
4． 用10 CV Wash buffer清洗杂蛋白，最后一滴用Bradford检测，如果Bradford变蓝则应该适当增加Wash体积，直到Bradford检测不变蓝；
5． 用Elution buffer将目标蛋白洗脱，用EP管分管收集，直到Bradford检测不变蓝；
6． 洗脱完成之后用5 CV Elution buffer洗Glutathione Agarose，再用10 CV纯水洗，最后加20%酒精，保存在4℃冰箱。
GST融合蛋白纯化常见问题及解决方案
问题一：目的蛋白与磁珠不结合或结合效率低
谷胱甘肽巯基转移酶(GST)是体内生物转化最重要的Ⅱ相代谢酶之一，是细胞抗损伤、抗癌变的主要解毒系统。GST是一个含有211个氨基酸的蛋白，通常将该蛋白加入到重组蛋白的末端以便对该重组蛋白进行纯化或检测。具有组氨酸的非融合蛋白会产生非特异性结合，这会阻碍组氨酸标签的亲和纯化。但GST标签则与之不同，由于GST对于其底物-谷胱甘肽具有极高的特异性，所以可以获得更高的纯度。
优点：增加外源蛋白的可溶性；适用范围广；可用不同的蛋白酶方便去除；高特异性，纯化方便且温和；提高外源蛋白的稳定性；保留了蛋白的抗原性和生物活性。
缺点：分子量较大，可能会影响蛋白的功能和下游实验，纯化后需要去标签；如果蛋白表达为包涵体，无法直接用GST标签纯化，可变复性后再进行纯化。
GST标签蛋白纯化操作中需要的几种Buffer：
Lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10% Glycerol;
Equilibration/Wash buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0;
Elution buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 15 mM Reduced Glutathione；
Regeneration buffer #1: 500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 8.5, 0.1% SDS;
Regeneration buffer #2: 500 mM NaCl, 100 mM NaOAc pH 4.5, 0.1% SDS.
注意：可直接称取Reduced Glutathione粉末溶解在Equilibration/Wash buffer中，但是溶解后加NaOH将pH调至8.0。
GST标签蛋白纯化操作流程：
1． 依据表达测试蛋白表达量选择合适体积的Glutathione Agarose (载量: 50 mg/ml)，用10 CV纯水将储存液中的酒精洗净，再用10 CV Equilibration buffer平衡；
2． 将平衡好的Glutathione Agarose加入已过滤的细胞裂解液中，4℃（或室温）孵育至少1小时；
3． 孵育后将裂解液加入亲和层析柱中，收集flow through，也可选择700 g，离心2 min，缓慢倒出上清液；
4． 用10 CV Wash buffer清洗杂蛋白，最后一滴用Bradford检测，如果Bradford变蓝则应该适当增加Wash体积，直到Bradford检测不变蓝；
5． 用Elution buffer将目标蛋白洗脱，用EP管分管收集，直到Bradford检测不变蓝；
6． 洗脱完成之后用5 CV Elution buffer洗Glutathione Agarose，再用10 CV纯水洗，最后加20%酒精，保存在4℃冰箱。
GST融合蛋白纯化常见问题及解决方案
问题一：目的蛋白与磁珠不结合或结合效率低