手把手教你做好引物设计
1660 人阅读发布时间:2021-08-13 09:56
20世纪后期发展的PCR技术改变了整个生物学研究的进程,其中引物设计的好坏直接关系到PCR的成败。
一、引物设计的基本原则
引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。在某些情况下(比如构建文库)是在不知道模板序列的情况下进行引物设计的,这个时候引物核苷酸序列与模板不是完全匹配。我们通常的引物设计都是在已知模板序列的情况下进行,如下图1所示:
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图1 引物设计示意图
引物设计总体上包含三个程序:模板的获得、同源性分析以及引物筛选。模板的获得有多种来源,根据实验目的来定,这里不多作讨论。同源性分析的目的是看引物与模板有没有非特异性结合位点,特别要避免非特异性结合位点的3’末端完全配对。为最大程度确保获得较好的PCR结果,引物筛选需要满足以下几项基本原则:
1.引物长度:18-30 nt
大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸,引物长度的上限并不是很重要,主要与反应效率有关。引物越长,退火结合到靶DNA上形成稳定双链模板的速率越小。特殊情况下可以进一步延长到50-60 bp,但长引物的合成出错率高,价格贵,而且难以合成,因此较为少见。另外,上下游引物的长度最好基本相等,最多相差不超过3 bp。
2.引物GC含量:40-60%
A、T、G和C四种碱基要在引物中分配均匀,如果引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。
3.引物的退火温度:55~75 ℃
退火温度需要比解链温度(Tm)低5 ℃,如果引物碱基数较少,可以适当提高退火温度,反之亦然。一对引物的退火温度相差4~6 ℃不会影响PCR的产率,但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的。扩增产物的Tm值与引物的 Tm值相差不能大于10 ℃。
4.避免扩增模板的二级结构区域
用有关计算机软件可以预测目的片段的稳定二级结构,选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。
5.引物末端不应超过3个连续的G或C
引物在G+C富集区容易错误引发,除在特殊的PCR(AS-PCR)反应中,引物3’端不能发生错配。如扩增编码区域,引物3’端不能终止于密码子的第3位,因为密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率。
6.引物不能形成二级结构