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上海富衡生物科技有限公司
入驻年限：5 年
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刘胜富
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上海 闵行区
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抗体、ELISA 试剂盒、细胞库 / 细胞培养、论文服务、试剂、实验室仪器 / 设备、技术服务、耗材
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技术资料/正文
做CHO稳转株，嘌呤霉素杀伤曲线到底该怎么摸？（下篇：实操篇） | 富衡生物
25 人阅读发布时间：2026-08-18 14:23
上篇我们聊了杀伤曲线的原理——为什么要做、CHO为什么难杀、嘌呤霉素的作用机制。这篇来点实际的：标准操作流程、结果怎么看、常见坑和细胞系对比。
四、标准操作流程
Day -1：铺板
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消化CHO细胞，计数，台盼蓝确认活力≥95% -
24孔板，3-5 × 10⁴ cells/well，1 mL完全培养基 -
37℃、5% CO₂过夜培养
铺板密度关键：Day 0加药时汇合度控制在30-50%。CHO增殖不算特别快（倍增时间约14-18h），但如果铺太密，加药时还在疯长，会干扰杀伤判断。
Day 0：配制药物 & 加药
用完全培养基现配各浓度梯度工作液。考虑到CHO细胞对嘌呤霉素的耐受性差异大，建议浓度梯度覆盖到15 μg/mL：
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每组3个复孔。吸掉旧培养基，每孔加1 mL对应浓度的含药培养基。
Day 1-7：每天观察 & 换液
每天要做的事： 1. 显微镜下观察，拍照 2. 记录细胞密度（与Day 0对比）、形态变化、漂浮情况 3. 换新鲜的含药培养基（嘌呤霉素37℃下会降解，不换液药效衰减）
观察记录模板：
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（以上为CHO-K1的参考趋势，实际结果因亚株和代次而异。注意CHO在低浓度组的杀伤可能持续5-8天才完全死亡，比HEK293等细胞系慢。）
五、结果怎么看
理想结果
找到一个浓度：在3-5天内100%杀死所有细胞，低于这个浓度杀不死或杀得慢。
选择原则
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首选3-5天内完全杀死所有细胞的最低浓度。 -
浓度太低（比如7天还没死完）→ 筛选窗口太长，未感染细胞偷偷长回来，假阳性风险 -
浓度太高（比如2天就死光）→ 筛选压力过大，可能对后续稳转株造成不必要的应激 -
3-5天全死是经验上的“舒适区”
实际选择示例
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如果2 μg/mL在Day 4全死，4 μg/mL在Day 2全死 → 选2 μg/mL -
如果4 μg/mL在Day 3全死，2 μg/mL在Day 6全死 → 选4 μg/mL（2 μg/mL筛选窗口偏长） -
如果所有浓度7天都没杀完 → 换一批细胞，或者确认嘌呤霉素是否失效
六、那些我踩过的坑（和你们可能也会踩的）
坑1：忘记每天换液
嘌呤霉素在37℃培养基中半衰期有限。Day 1加的药，到Day 3活性已经降了不少。不换液的话，你以为你在用2 μg/mL筛选，实际上可能只剩1点几了。
后果：低浓度组“看起来没死”，但其实药效在衰减，你误判了致死浓度。
坑2：铺板密度太高
Day 0铺了80%汇合。加药后细胞还在长，尤其是低浓度组（0.5-1 μg/mL），细胞可能一边被药物压制一边还在增殖，看起来像是“没被杀死”。
后果：误以为这个浓度杀不死，把筛选浓度选高了。
坑3：细胞状态不好
用高代次、生长缓慢的CHO细胞做杀伤曲线。这些细胞本身就长得慢，加了低浓度嘌呤霉素后死得也慢，但原因不是药物耐受，是细胞本身就虚。
后果：杀伤曲线整体右移，选了一个偏高的筛选浓度。
建议：用低代次（<20代）、对数生长期的CHO细胞做杀伤曲线。
坑4：把杀伤曲线和感染实验混在一起做
有人为了省事，把杀伤曲线和慢病毒感染放在同一天开始。但杀伤曲线至少需要5-7天才能得出结论，而感染实验的细胞在等这个结果。
正确顺序：先做杀伤曲线 → 确定筛选浓度 → 再做感染 → 感染后72h用确定好的浓度筛选。
坑5：只看一天就下结论
嘌呤霉素的杀伤不是“一刀切”，CHO细胞可能在Day 2看起来还有30%活着，Day 3突然全部崩盘。只看Day 2就判断“这个浓度杀不死”，会低估实际杀伤力。
建议：至少观察到所有组全部死亡或Day 7，才能下结论。
坑6：忽略了CHO细胞“越养越耐药”的可能
前面说过，CHO细胞有获得性嘌呤霉素抗性的风险。如果你发现手上的CHO在8 μg/mL甚至10 μg/mL都还活着，不要直接认为是“正常现象”就完事了，有可能是这批细胞在长期培养过程中已经获得了抗性。
怎么办？做一个撤药回复实验：
1. 把疑似耐药的CHO细胞撤掉嘌呤霉素，正常传代10-20代
2. 重新做一次杀伤曲线
3. 如果撤药后敏感性恢复（比如从10 μg/mL降到4 μg/mL就能杀死），说明之前是获得性抗性
4. 如果敏感性没变，说明可能是细胞本身的特性，或者有更稳定的抗性突变
从近缘细胞系V79的研究来看（Morrow et al., 1980），获得性嘌呤霉素抗性是不稳定的，撤药后可以恢复——如果CHO的抗性机制类似，撤药回复应该有效。但如果你的CHO撤药后依然耐药，建议做一下STR鉴定排除交叉污染的可能性，或者考虑其他更稳定的抗性机制。
七、CHO vs 其他细胞系的差异
如果你同时做多种细胞的杀伤曲线，注意以下差异：
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不要跨细胞系套用浓度，即使都是CHO，K1和S的耐受性可以差5-10倍。更关键的是，同样是CHO-K1，不同实验室因为传代历史不同，耐受性可以从4到15 μg/mL。
八、写在最后
杀伤曲线这件事，说难不难，说简单也不简单。难在很多人觉得“差不多就行”，结果后面筛选出了各种问题又回来返工。
老老实实花一周时间摸一次曲线，后面做稳转株就是按部就班的事。
磨刀不误砍柴工，这句话在细胞实验里永远适用。
参考文献：
ThermoFisher Puromycin Selection Guide — 各细胞系推荐筛选浓度参考
INVIVOGEN Puromycin killing curve protocol
Broad Institute TRC Lentiviral Infection Protocol
Morrow TF et al. Isolation and characterization of puromycin-resistant mutants from Chinese hamster cells. Mutation Research, 1980. — V79中国仓鼠肺细胞嘌呤霉素抗性机制研究
5. CN120905487A — 一种基因缺失CHO细胞系及其制备方法与应用（澳斯康生物，2026）。野生型CHO-K1嘌呤霉素杀伤曲线：10 μg/mL 4天全死
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