- 移动端
西安百萤生物科技有限公司代理商
13 年
手机商铺
商家活跃：
产品热度：
- NaN
- 0
- 0
- 2
- 2
推荐产品
技术资料/正文
百萤问号：Western Blot实验中常见问题解答（二）
126 人阅读发布时间：2024-03-25 08:50
Western 免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的实验。在WB 实验中常会出现各种问题，而拖慢实验速度，使实验达不到理想的效果。今天百萤跟各位同学一起分享下 WB 实验中各种问题及问题建议。
| 杂带较多 | 目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点，糖基化位点，乙酰化位点等），本身可以呈现多条带 | 查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白试剂大小 |
| 目的蛋白有其他剪切本 | 查阅文献或生物信息学分析可能性 | |
| 样品处理过程中目的蛋白发生降解 | 裂解液中加入蛋白酶抑制剂，样品处理在冰上进行 | |
| 上样量过高，太敏感 | 适当减少上样量 | |
| 一抗不纯 | 纯化抗体 | |
| 一抗特异性不高 | 重新选择或制备高特异性的抗体 | |
| 二抗的非特异性结合 | 增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。可选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链） | |
| 一抗或二抗浓度偏高 | 降低抗体浓度 | |
| 细胞传代较多，导致蛋白变异 | 使用原代或传代少的细胞作对照 | |
| 蛋白条带位置 （大小）不对 |
二聚体或多聚体存在 | 增加蛋白质变性过程及强度 |
| 翻译后剪切 | 比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的，在执行功能时需要进行剪切成活化的形式 | |
| 相对电荷 | 氨基酸电荷的组成 | |
| 蛋白修饰 | 比如糖基化、磷酸化等修饰状态会导致蛋白分子量增加 | |
| 胶浓度 | 不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差 | |
| 无蛋白条带 | 抗体孵育不充分 | 增加抗体浓度，延长孵育时间 |
| 酶失活 | 直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物 | |
| 标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 | 设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因 | |
| 试剂之间不匹配 | 一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性 | |
| 一抗失效 | 选择在有效期内抗体，幷选择现配现用的工作液 | |
| HRP 抑制剂 | 所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠 | |
| 抗体不能识别测试种属的相关蛋白 | 购买抗体前应认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白 | |
| 二抗与一抗不匹配 | 选择针对一抗来源种属的抗体 |
百萤生物是美国AAT Bioquest中国区域代理商，为您提供AAT Bioquest优质的产品、详尽的技术和前沿的资讯，欢迎来电咨询！