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技术资料/正文
百萤问号：Western Blot实验中常见问题解答(一)
94 人阅读发布时间：2024-03-25 08:48
Western 免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的实验。在WB 实验中常会出现各种问题，而拖慢实验速度，使实验达不到理想的效果。今天百萤跟各位同学一起分享下 WB 实验中各种问题及问题建议。
百萤生物是美国AAT Bioquest中国区域代理商，为您提供AAT Bioquest优质的产品、详尽的技术和前沿的资讯，欢迎来电咨询！
| 常见问题 | 可能原因 | 建议 |
| 电泳条带成笑脸状 | 胶不均匀冷切，中间冷却不好，电泳系统温度偏高 | 减少电压减慢电泳速度，在冷室或者冰浴中进行电泳 |
| 电泳条带成皱眉状 | 可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全 | 调整装置 |
| 拖尾 | 样品溶解不好 | 样品充分溶解混匀后上样 |
| 纹理(纵向条纹) | 样品中含有不溶性颗粒 | 样品充分搅拌混匀 |
| 条带偏斜 | 电极不平衡或者加样位置偏斜 | 调整电极和加样 |
| 条带两边扩散 | 加样量过多 | 适当减少上样量 |
| Marker 变黑色 | 抗体和 Marker 蛋白反应 | 在 Marker 和 sample 之间空出一个孔不上样 |
| 背景高 | 膜封闭不够 | 延长封闭时间，选择适宜的抗体稀释度 |
| 一抗稀释度不适宜 | 对抗体进行滴度测试，选择适宜的抗体稀释度 | |
| 一抗孵育的温度偏高 | 建议 4℃ 结合过夜 | |
| 二抗浓度度过高 | 降低二抗浓度 | |
| 二抗的非特异性背景 | 增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。可选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链） | |
| 二抗孵育时间过久 | 减少二抗孵育时间 | |
| 选择膜的问题 | 硝酸纤维素的背景会比 PVDF 膜低 | |
| 膜在实验过程中干过 | 实验过程中要注意保持膜的湿润 | |
| 检测时曝光时间过长 | 注意曝光时间的缩短 | |
| 洗膜不充分 | 增加洗膜的时间和次数 | |
| 抗体和封闭蛋白有交叉反应 | 检测抗体与封闭蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应 |
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