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百萤问号：Western Blot实验中常见问题解答（三）
95 人阅读发布时间：2024-03-25 08:52
百萤问号：Western Blot实验中常见问题解答
Western 免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的实验。在WB 实验中常会出现各种问题，而拖慢实验速度，使实验达不到理想的效果。今天百萤跟各位同学一起分享下 WB 实验中各种问题及问题建议。| 蛋白条带信号弱 | 抗体孵育不充分 | 增加抗体浓度，延长孵育时间 |
| 酶活性降低 | 直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物 | |
| 洗膜过度 | 洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用 0.1% 的弱去垢剂 Tween-20 | |
| 标本中靶蛋白含量太低 | 增加样本上样量 | |
| 抗体活性降低 | 选择有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置 | |
| 蛋白转移不充分 | 可以用丽春红染膜幷结合染胶（考马斯蓝）后确定条带是否转移到膜上或转移过度，适当调整转膜的时间和电流 | |
| 封闭过度 | 减少封闭剂的量或缩短时间，换用不同封闭剂类型 | |
| 曝光时间过短 | 延长曝光时间 | |
| HRP 抑制剂 | 所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠 | |
| 背景有黑色斑点 | 抗体与封闭试剂反应 | 使用前过滤封闭试剂 |
| HRP 偶联二抗中有聚集体 | 过滤二抗试剂，去除聚集体 | |
| 暗背景上白色带 | HRP 含量过高 | 降低酶联二抗的浓度 |
| 背景有不均匀的白色斑点 | 转膜过程中有气泡存在 | 仔细检测，避免存在气泡 |
| 抗体分布不均匀 | 孵育抗体时使用摇床 |
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