百萤问号：Western Blot实验中常见问题解答

Western 免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的实验。在WB 实验中常会出现各种问题，而拖慢实验速度，使实验达不到理想的效果。今天百萤跟各位同学一起分享下 WB 实验中各种问题及问题建议。

蛋白条带信号弱	抗体孵育不充分	增加抗体浓度，延长孵育时间
	酶活性降低	直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物
	洗膜过度	洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用 0.1% 的弱去垢剂 Tween-20
	标本中靶蛋白含量太低	增加样本上样量
	抗体活性降低	选择有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置
	蛋白转移不充分	可以用丽春红染膜幷结合染胶（考马斯蓝）后确定条带是否转移到膜上或转移过度，适当调整转膜的时间和电流
	封闭过度	减少封闭剂的量或缩短时间，换用不同封闭剂类型
	曝光时间过短	延长曝光时间
	HRP 抑制剂	所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠
背景有黑色斑点	抗体与封闭试剂反应	使用前过滤封闭试剂
背景有黑色斑点	HRP 偶联二抗中有聚集体	过滤二抗试剂，去除聚集体
暗背景上白色带	HRP 含量过高	降低酶联二抗的浓度
背景有不均匀的白色斑点	转膜过程中有气泡存在	仔细检测，避免存在气泡
背景有不均匀的白色斑点	抗体分布不均匀	孵育抗体时使用摇床