了解PCR array —— 你问我答（二）

关于PCR array的设计：

Q: PCR array 上的基因是怎么选择的？
A: PCR arrays 上基因的选择至关重要。这些被选中的基因并不仅仅是简单的包括某个信号通路中的所有基因，所选基因必须对于相应的信号转导途径相当重要，并且是在mRNA 水平上调控的。Qiagen的研发人员及生物信息学科学家通过阅读已发表文献或多个数据库来筛选相关的基因，然后再用文本发掘的方法进行校对，同时研发部门做了大量实验来证明所选基因的相关性，并与学术界的权威密切合作，所选的基因都经过了他们的认可。

Q：PCR array的引物有何特点？
A：通过计算机分析和实验验证，引物达到以下要求：
特异性：通过BLAST等比对方法，检测确认引物在相应物种（人，小鼠或大鼠）全基因组中的高度特异性，有效避免非特异性产物产生。并通过实验证明引物不会扩增E.coli基因组，后者是Taq DNA多聚酶的常见污染源。

均一性：所使用的引物的CG含量，解链温度（Tm），以及其他一些化学的和物理的特性都相似，以保证在相同的PCR条件（尤其是相同退火温度）下，芯片中的不同的基因都能扩增出特异性产物。

扩增效率：引物扩增的片段大小均在100到200bp左右，确保在相同的反应时间内，不同的基因均能扩增出完整片段；并增强引物3’端的铆定能力，减少引物二聚体和非特异性退火的发生。

Q：如何保证相同的PCR反应条件下保证不同的基因有相近的扩增效率？
A：PCR array的难点是如何在相同的PCR反应条件下保证不同的基因有相近的扩增效率，并且获得与单个基因实时定量PCR反应相当的灵敏度，特异性和可重复性。首先设计筛选出最佳的候选引物，接着通过实验，在不同反应条件下，检测PCR反应体系与几千条PCR引物的组合，最终获得了优化的引物和PCR反应体系，适应PCR array的要求。

Q：PCR array的plate构成？
A：如下图所示：A1 至G12的84个孔用于检测某信号通路或某生物学功能相关的84个特异性基因。H1 至H5的5个孔用于检测5种看家基因，在数据分析时用于校正。 H6孔是基因组DNA对照孔 (GDC)，用于检测样本中的基因组DNA污染。 H7 至H9孔为反转录对照孔(RTC)，用于检测反转录效率。H10至H12孔为阳性对照孔 (PPC)。

图2.1 PCR array的plate展示图
 

Q：如何设置对照孔进行质控？
A：每个产品均有5个看家基因检测以用于数据归一化。基因组DNA污染质控 (GDC) 则用于检测特定非转录基因组DNA污染，具有高度敏感性。逆转录反应质控 (RTC) 用于检测逆转录反应效率，因为它可以检测RT2 First Strand 试剂盒反应时利用内含的外源 RNA所产出的特定模板量。 PCR反应质控 (PPC) 用于检测PCR反应本身效率。其内含特殊加入的DNA 片段及检测材料。在给定的反应条件下，应检测到一定的实时定量PCR信号。 重复的质控检验可用于孔间及盘间的一致性检测。

Q：阴性和阳性对照孔的Ct值应达到何标准？
A：3个RTC孔Ct值之间的差值必须小于1；3个PPC孔也是如此。基因组DNA污染检测孔（GDC）的Ct值必须大于35，或者无检测信号。RTC与PPC孔Ct的差值必须小于5。

Q：为什么需要5个看家基因？
A：通过研究发现并不是所有的看家基因都能在所有的细胞类型，所有的组织，所有的阶段都有恒定的表达。它们的表达量变化可能会较大，那么只使用一个看家基因作为内参，可能会导致错误的结论。因此放置5个看家基因，在完成实验以后，需要从中筛选出若干个真正稳定表达能够起到内参作用的看家基因做为对照。