腺相关病毒(Adeno-associated virus,简称AAV)是一种对人类没有致病性的细小病毒(Parvovirus)。虽然AAV感染在人类中很常见,但与任何已知疾病无关;加上其转导分裂细胞和静止细胞的能力、非常低的免疫原性以及转基因长期表达(与野生型AAV病毒感染后整合到宿主细胞DNA不同,重组AAV载体主要作为染色体外游离体长期存在),这些特性使AAV成为炙手可热的用于基因治疗的病毒载体。我们开发出一系列专有技术和试剂,从病毒滴度、纯度、活性以及一致性等方面显著提升了腺相关病毒包装工艺水平。
试验验证
三质粒转染法生产的AAV
我们开发了一系列专有技术用于优化我们的Baculovirus-AAV包装流程。因此我们的病毒在转导哺乳动物细胞时表现出良好的转导效率。
图1 向HEK293T细胞转导18种血清型的重组AAV病毒,这些AAV病毒均使用CMV>EGFP载体(VB010000-9394npt)。转导后48小时的EGFP表达效果如下图所示。比例尺:100 um。
图2 向HeLa细胞转导18种血清型的重组AAV病毒,这些AAV病毒均使用CMV>EGFP载体(VB010000-9394npt)。转导后48小时,EGFP(A)的荧光强度中值(MFI)和(B)细胞阳性率通过流式细胞术检测。(C)不同血清型AAV的EGFP表达效果如下图所示。比例尺:100 um。
图3 向Huh-7细胞转导18种血清型的重组AAV病毒,这些AAV病毒均使用CMV>EGFP载体(VB010000-9394npt)。转导后48小时,EGFP(A)的荧光强度中值(MFI)和(B)细胞阳性率通过流式细胞术检测。(C)不同血清型AAV的EGFP表达效果如下图所示。比例尺:100 um。
杆状病毒生产的AAV
我们开发了一系列专有技术用于优化我们的杆状病毒生产AAV的流程。我们的杆状病毒生产的AAV在转导哺乳动物细胞时表现出良好的转导效率。
图4 表达EGFP的杆状病毒生产的AAV转导HEK293T细胞,血清型为AAV1和2,MOI 10000。左:明场。右:EGFP。
订购信息
我们的科研级AAV病毒包装服务可以满足多样的AAV基因递送实验需求。您可以选择三质粒转染法包装AAV或者使用昆虫杆状病毒生产AAV。
ssAAV:
scAAV:
昆虫杆状病毒生产AAV:
科研级Plus AAV病毒包装:
我们的科研级Plus AAV病毒相较于常规科研级AAV具有更高的纯度,适用于需要排除包装细胞蛋白、内毒素等杂质的极为敏感的实验应用,也适用于那些对纯化方式、滴度、配方等有特定要求的需求。
注意:1. GC = Genome copies;2. 上表的价格和周期是基于CsCl密度梯度离心的纯化方法计算的。若您需要使用其它纯化方法(碘克沙醇梯度密度离心、亲和层析色谱、离子交换色谱等)
病毒类型
我们提供的AAV类型:
- 单链AAV(Single-stranded AAV,ssAAV)和自互补AAV(Self-complementary AAV,scAAV)
- 18种血清型:1、 2、3、4、5、6、6.2、7、8、9、rh10、DJ、DJ/8、AAV2-retro、AAV2-QuadYF和AAV2.7m8
- AAV空壳和类病毒颗粒(Virus-like particle,VLP)
我们提供的AAV的包装服务涵盖以下血清型:
1. 按照血清型分类:
2. 按照组织嗜性分类:
注意:携带目的基因的转移质粒上的ITR序列来自于AAV2。一般来说,包装不同血清型的AAV,指的是使用不同血清型的衣壳蛋白表达质粒,与携带AAV2 ITR的转移质粒进行包装。
对照病毒
为了更好地开展您的实验,我们按照“对照病毒与定制病毒的生物学应用相匹配”的原则给您赠送或者推荐对照病毒。例如,如果定制病毒表达一个基因,则推荐的对照病毒表达荧光蛋白EGFP。如果定制病毒表达打靶某个基因的shRNA,则对照病毒表达一个Scramble shRNA。推荐的对照病毒信息如下表所示:
辅助病毒
为了更好地开展您的实验,我们按照“辅助病毒与定制病毒的生物学应用相匹配”的原则给您推荐辅助病毒。例如,如果定制病毒是一个只含TRE启动子的TetOn慢病毒,则需要一个表达rtTA的辅助病毒,才能进行诱导表达实验。推荐的辅助病毒信息如下表所示:
运输/储存
我们的AAV病毒存储在特殊的Tris缓冲液或PBS缓冲液中,并采用干冰运输。收到AAV病毒后,立即放置于-80℃,可保存约一年。若放置于-20℃,则可保存2-3周。融解后的AAV病毒可在4℃保存1-2周。虽然AAV病毒比其他多数病毒稳定(如慢病毒),但是也请避免反复冻融,因为这会导致AAV病毒滴度显著下降。
不同级别的AAV比较
下表比较了我们不同级别的AAV病毒。
生产/质控
三质粒转染法生产AAV
杆状病毒生产AAV
我们的使用杆状病毒包装AAV的工作流程包括两个主要步骤,如图1所示。步骤1中产生两种重组杆状病毒,第一个表达目的基因(GOI),其两侧有AAV反向末端重复序列 (Inverted terminal repeat,ITR),第二个则是辅助杆状病毒表达AAV rep和cap基因。在步骤2中,通过将步骤1产生的两种重组杆状病毒共同感染昆虫细胞来产生重组AAV颗粒。
为产生两种重组杆状病毒(一种表达GOI,其两侧是AAV ITR;另一种表达AAV rep/cap基因),首先需要将每种杆状病毒的表达盒克隆至杆状病毒转移载体中。然后将杆状病毒转移载体与表达Tn7转座酶的辅助质粒共转化至含有杆状病毒穿梭空载体(又名杆粒)的细菌宿主中,以产生重组杆粒。然后将重组杆粒转染到昆虫Sf9细胞中。经过短暂的孵育期,从培养基中收集病毒颗粒并使用蔗糖梯度密度离心进一步浓缩。我们采用qPCR测定杆状病毒滴度。然后将两种重组杆状病毒共感染昆虫细胞中。在72-96 小时的孵育期后,从细胞裂解液和上清液中收集AAV颗粒,并通过PEG沉淀法进行浓缩。对于超纯化 AAV(体内应用级别),AAV病毒颗粒通过氯化铯 (CsCl) 梯度超速离心进一步纯化和浓缩。我们使用qPCR测定AAV滴度。
对于每个我们生产的AAV,我们的QC包括qPCR滴度测定(Titer measurement)、微生物检测(Bioburden test,针对细菌、真菌)、支原体检测(Mycoplasma test)等。若转移载体同时编码一个荧光蛋白,我们还会将病毒进行细胞转导以测定相应的荧光表达情况(Transduction test)。此外,对于超纯化AAV病毒,我们还可以检测内毒素水平(Endotoxin test)和使用SDS-PAGE方法检测病毒纯度(Virus purity test)。
下表展示了我们可提供的AAV QC方法。
另外,我们开发了一系列专有技术用以优化三质粒转染法包装AAV的效率。我们的病毒经过验证,在哺乳动物细胞中表现出很高的转导效率。
滴度保证
我们的滴度保证仅适用于包装进病毒的区域(从5’ ITR到3’ ITR)小于腺相关病毒承载限度(4.7 kb,~野生型AAV2基因组长度)的载体。超过该范围,超出4.7 kb的那部分序列在包入衣壳时会被剪切掉,导致包装出来的AAV病毒颗粒含有不完整的基因组,不仅影响ITR qPCR滴度检测,而且影响转基因表达。此外,对于如下情况,我们同样不能保证滴度:
- AAV血清型3、4、6、6.2、2.7m8的滴度通常偏低。对于这些血清型我们保证其滴度是其它血清型最小滴度的50%。
- 包含对包装过程有不利影响的序列,例如毒性基因(如促凋亡基因);破坏包装细胞或病毒的完整性(如导致细胞聚集的膜蛋白)的基因 ;易于重排或者产生二级结构的序列(如重复序列或者高GC含量序列)。
- ⽤户提供的载体,因为我们无法控制载体质量。
客户提供载体
如需客户提供AAV病毒载体,则请按照外来物品接收指南(详情见产品资料)将载体寄送给我们。请严格按照我们的指南来进行装运以免造成物品的任何延误和损坏。客户提供的所有材料均需经过QC检测,每一份材料附加检测费用。请注意,客户提供物品接收并通过QC之后生产才正式开始。
若您想了解更多技术详情、促销活动或定制化服务,可搜索关注“载体家”公众号咨询