llllcjchina: 做磷酸化蛋白的Western blotting之我见
新手做磷酸化蛋白的Western blotting要注意:1,操作尽量低温。2,细胞裂解液中要加磷酸酶抑制剂。3,一抗尽量选择多克隆抗体。
发表于2009-12-29 09:41
seagate: 穷人中的劳斯莱斯--我五年western blot体会(2)
分享我五年western blot体会的几点体会:1. Western Blot实验条件;2. Western Blot实验关键。
发表于2010-08-26 16:05
seagate: 穷人中的劳斯莱斯--我五年western blot体会(1)
分享我五年western blot体会的几点体会:1. 抗体的选择;2. Western Blot设备。
发表于2010-08-26 16:05
ptglab: 有谁做过分子量小于10kD的weastern blot?
我做过很多, 用0.45um孔径的PVDF膜就跟本做不出来,我用的是PSQ膜, 很好用。不要再浪费时间了。 另外我有一方法但不保证每次都成功, 可以用0.45um的膜做。
发表于2003-08-13 14:05
zhulqboy: WESTERN-BLOT结果背景不干净的原因
WESTERN-BLOT结果背景不干净的原因: 1.首先要考虑的是你的胶的制作有没有问题? 2.电泳缓冲液是不是好的? 3.转膜的时候,是不是把滤纸全部浸润了,胶是不是平的? 4.背景不干净一般都是封闭和漂洗的问题。
发表于zhulqboy
rarazhuzhu: western-blot结果出现混乱的黑色影子,没见明显条带的原因是什么?
western-blot结果出现混乱的黑色影子,没见明显条带的原因主要是恒压转膜方面、可能是block这部出了问题、1抗孵育条件和时间、2抗浓度太高。
发表于2010-07-25 07:41
原核表达本身是否能做出来是靠运气的,应该先用考马斯亮蓝验证,因为这个技术好做。而Western blot如果不熟练容易出问题。如果你们实验室Western做得不怎么样,那么一个靠运气的技术用一个有问题的技术是无法验证的。
发表于2011-11-06 09:58
bigman2003: 我做Western-blot的一点经验分享
我属于做Western-blot的新手,刚刚学习该技术不过1个多月,目前利用周末完成实验,平时还要上班管病人。我现在跑的蛋白已经很清晰了,背静很干净。在开始做之前摸条件,我先是跑胶,然后考染,不转膜,看是否有蛋白提取出来,走的条带是否清晰,做了3次左右,然后染了两次Actin 一抗,最后自己的抗体到了只摸索了一次就开始正式实验了。在做之前也是到该论坛学习了很多知识,可以说收获不小,为我顺利开始自己的实验打下了基础。现在我有了一些体会,也来这里跟大家分享一下。
发表于2010-05-11 21:44
bacteria_virus: 有关western-blot的原理
蛋白质变性是高级结构改变,一级结构未改变。抗原表位有线性表位和构象表位之分,不同的抗体可能识别的就不一样。做WB的抗体识别线性表位。我觉得,做WB,与抗体反应,这不能判断蛋白的活性。
发表于2007-02-28 20:46
fangweibin119: western blot问题解答
从组织提的蛋白,分子量180kd,上样量40ug,70v,110v电泳,300mA两小时湿转,5%脱脂奶粉室温封闭2小时,santa一抗 1:500TBST稀释(推荐1:100-1:1000)4°C孵过夜,国产二抗1:2000TBST稀释(推荐1:2000-1:5000)室温2+小时。都是TBST洗膜3*10min。发光剂是碧云天ECL PLUS。几乎整张膜都发光,像盏黑夜里的明灯,失败的原因分析。
发表于2009-03-13 12:48