western-blot结果出现混乱的黑色影子,没见明显条带的原因是什么?
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rarazhuzhu
发表于 2010-07-25 07:41
首先恒压转膜方面,我用140ma恒流转过15-120kd的蛋白,因为机器用了多年,转膜时间相应的有原来的60min,调整到现在的85min(这个和机器的新旧程度相关)。那么楼主对你使用的机器不了解,可以先用少量样品测试下转膜时间。 另外在测试操作中,使用2张膜一起转来判断你的转膜时间,拿2张膜(也就是上层的膜)用考马斯蓝看下,如果2张膜同时出现蛋白,说明你转膜时间长了,如果2张都没有转上,说明你时间短了。寻找合适你机器转膜的时间,可能需要点时间,但是只要你找到后,你以后就放心大胆用这个条件了。
然后是黑影方面问题,从楼主字面来看,应该是暴光后片子上出现大面积的黑影,从而看不到目的蛋白条带是吗。 第1,可能是block这部出了问题,我用的是5% silk milk block 1小时,足够安心;第2,1抗孵育条件和时间,楼主在常温下孵育时间过长,可以尝试着孵育1h-1.5h看下,但是不建议楼主用常温,相对来说,用4度过夜是最好的(这点和楼上相同);第3,楼主的2抗浓度太高了,建议调整到1:20000使用;第4,使用ecl显影液时,一定要把膜上的ecl尽可能的吸干,残留太多的话,也会出现以上结果。