bigman2003
发表于 2010-05-11 21:44
我属于做Western-blot的新手,刚刚学习该技术不过1个多月,目前利用周末完成实验,平时还要上班管病人。我现在跑的蛋白已经很清晰了,背静很干净。在开始做之前摸条件,我先是跑胶,然后考染,不转膜,看是否有蛋白提取出来,走的条带是否清晰,做了3次左右,然后染了两次Actin 一抗,最后自己的抗体到了只摸索了一次就开始正式实验了。在做之前也是到该论坛学习了很多知识,可以说收获不小,为我顺利开始自己的实验打下了基础。现在我有了一些体会,也来这里跟大家分享一下。
我做的冻存的动物组织,用玻璃研磨器研磨提取蛋白。
1. 提取,组织一定要切成小块,可以用剪刀剪或刀切,剪碎后再提取,蛋白浓度能高出一倍来。
2. 研磨一定要在冰上进行,一般间断研磨30分钟就足够了。
3. 离心,我一般30分钟。
4. 电泳,网上有人说胶要提前一天灌好,放一夜再用(有人说放冰箱里,有人说室温),结果发现室温放置后第二天上样孔处就干了,变形不好上样;最关键的是,我发现,当天新灌的胶走出来的条带清楚,而提前一天做的则走出来条带模糊;所以建议大家还是当天做胶比较好。我一般是到实验室后,把制冰机打开,大冰冻离心机打开,然后开始做胶,把分离胶灌好以后,开始提取蛋白,1小时左右开始离心了,再灌浓缩胶;这样胶大约有一个小时的凝固时间,足够了。 要注意的是,灌完分离胶加水的时候,要贴玻璃板的一个角加水,否则胶的局部会受到影响,影响电泳条带笔直度。
5. 电泳缓冲液可以重复用; 做胶的试剂买分析纯的一般试剂使用一点问题都没有,不用买进口的很贵的所谓专用试剂; 我的蛋白分子量分别是40 和170,我分离胶用10%,浓缩用4%,一点问题都没有,都走的很好,分的很开。
6. 转膜,我一般电湿转,80 V 电压转2小时,即使分子量170 kDa 的蛋白也能转得过去,不用过夜的转法,节省时间;我的40 kDa 和170 kDa 蛋白一起转,没有问题。
7. 封闭,我用5%奶粉,专用的,室温下摇晃封闭1小时,太长了没必要,更不必过夜。
8. 一抗,我用的是Santa的一抗,1:400稀释(10 ul/4 ml 牛奶),用杂交袋摇晃杂交1小时,没必要过夜;用杂交袋很省抗体;抗体最好不重复用;但是我当天重复用两次,效果也还可以;杂交的时候要保持蛋白面超上。
9. 洗一抗,我是室温下洗10 X 3次。
10. 二抗,我用1:2000,室温杂交50分钟,也是用杂交袋,6 ml 左右,我的膜比较大。
11. 再洗二抗,同前。
12. 显色,我是把膜蛋白面朝上放在培养皿上,然后往上面滴显色AB液,反应2-3分钟,然后不擦干直接放暗盒里,上面盖层保鲜膜,用笔画出膜的边缘,以免暗室内找不到膜的位置。
13. 洗片,我用培养皿装显影剂,节省啊,然后捞出后用水冲一下,再放进定影液里。
以上是我的一些经验。有人说做Western一次需要两天,而我一天内全部完成,效果非常好,一般全程下来13小时左右。所以要提高实验进度,不妨这样来做,提高效率。