标签: 重叠延伸 PCR
重叠延伸PCR技术主要用于获得其它依靠限制性内切酶消化方法难以得到的产物。可用于:(1)基因的定点突变;(2)融合基因的构建;(3)长片段基因的合成;(4)基因敲除以及目的基因的扩增。
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尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因,样品间的交叉污染也是原因之一。因此,不仅要在进行扩增反应是谨慎认真,在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意:
1. 戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套;
2. 使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染;
3. 避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面;
4. 操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度;
5. 最后加入反应模板,加入后盖紧反应管;
6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照,即可验证PCR反应的可靠性,又可以协助判断扩增系统的可信性;
7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器,由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染,最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器,至少PCR操作过程中加样器应该专用,不能交叉使用,尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区;
8. 重复实验,验证结果,慎下结论。
重叠延伸PCR的模板用量
重叠延伸PCR在第二轮PCR时,两模板(回收后的第一轮PCR产物)的加入量应该如何计算?
1 评论
overlap PCR重叠片段问题
请问如主题标注的primer B和C一般需要多长的片段呢?我的两个需要overlap PCR的片段分别为3.7Kb和2.6Kb,中间overlap的片段为40bp,采用了上述的方法,但一直做不出来,不知道应该注意些什么事项,谢谢!
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