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实时荧光定量PCR(realtime PCR)

标签: 实时 荧光定量 PCR realtime PCR

所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

详细
实验方法
  • 实时荧光定量PCR
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、 样品RNA的抽提
 
1.  取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。
 
2.  两相分离 每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
 
3.  RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12 000 rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
 
4.  RNA清洗 移去上清液,每1 mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1 ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7 000 rpm离心5分钟。
 
5.  RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
 
6.  溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
 
二、 RNA质量检测
 
1.  紫外吸收法测定
 
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液 浓度和纯度。
 
 (1)浓度测定
 
A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下:
 
RNA溶于40 μl DEPC水中,取5 μl,1:100稀释至495 μl的TE中,测得A260 = 0.21
 
RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
 
取5 ul用来测量以后,剩余样品RNA为35 μl,剩余RNA总量为:
 
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
 
(2)纯度检测
 
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。
 
2.  变性琼脂糖凝胶电泳测定
 
(1)制胶
 
1 g琼脂糖溶于72 ml水中,冷却至60℃,10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10×MOPS电泳缓冲液
浓度  成分
0.4 M  MOPS,pH 7.0
0.1 M  乙酸钠
0.01 M  EDTA
 
灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
 
(2)准备RNA样品
 
取3 μgRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
 
(3)电泳
 
上样前凝胶须预电泳5 min,随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm电压下2 h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm。
 
(4)紫外透射光下观察并拍照
 
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。
 
三、样品cDNA合成
 
1.  反应体系
 
序号          反应物           剂量
1          逆转录buffer       2 μl
2         上游引物              0.2 μl
3         下游引物              0.2 μl
4          dNTP                   0.1 μl
5       逆转录酶MMLV     0.5 μl
6         DEPC水              5 μl
7          RNA模版            2 μl
8           总体积               10 μl
 
轻弹管底将溶液混合,6 000 rpm短暂离心。
 
2.  混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟,取出后立即冰水浴至管内外温度一致,然后加逆转录酶0.5 μl,37℃水浴60分钟。
 
3.  取出后立即95℃干浴3分钟,得到逆转录终溶液即为cDNA溶液,保存于-80℃待用。
 
四、 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因(β-actin)实时定量PCR
 
1.  β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011,反应前取3 μl按10倍稀释(加水27 μl并充分混匀)为1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104,以备用。
 
2.  反应体系如下:
 
标准品反应体系
 
序号           反应物                           剂量
1       SYBR Green 1 染料             10 μl
2       阳性模板上游引物F              0.5 μl
3      阳性模板下游引物R              0.5 μl
4                 dNTP                            0.5 μl
5                 Taq酶                           1 μl
6           阳性模板DNA                    5 μl
7              ddH2O                            32.5 μl
8               总体积                            50 μl
 
轻弹管底将溶液混合,6 000 rpm短暂离心。
 
3.  管家基因反应体系:
 
序号            反应物                                剂量
1      SYBR Green 1 染料                   10 μl
2      内参照上游引物F                         0.5 μl
3     内参照下游引物R                         0.5 μl
4               dNTP                                    0.5 μl
5               Taq酶                                   1 μl
6      待测样品cDNA                             5 μl
7              ddH2O                                  32.5 μl
8             总体积                                    50 μl
 
轻弹管底将溶液混合, 6000 rpm短暂离心。
 
3.  制备好的阳性标准品和检测样本同时上机,反应条件为:93℃ 2分钟,然后93℃ 1分钟,55℃ 2分钟,共40个循环。
 
五、 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
 
1.  针对每一需要测量的基因,选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
 
2.  反应体系
 
序号                     反应物                        剂量
1                     10× PCR缓冲液            2.5 ul
2                           MgCl2 溶液              1.5 ul
3                           上游引物F                 0.5 ul
4                           下游引物R                0.5 ul
5                            dNTP混合液            3 ul
6                            Taq聚合酶               1 ul
7                             cDNA                       1 ul
8                    加水至总体积为               25 ul
 
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
 
35个PCR循环(94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟); 72?C延伸5分钟。
 
(3)PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
 
(4)将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。
 
六、 待测样品的待测基因实时定量PCR

1.  所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。
 
2.  体系配置如下:
 
序号             反应物                                剂量
1            SYBR Green 1 染料               10 ul
2                上游引物                               1 ul
3                下游引物                               1 ul
4                  dNTP                                   1 ul
5              Taq聚合酶                               2 ul
6             待测样品cDNA                        5 ul
7                   ddH2O                              30 ul
8                   总体积                               50 ul
 
轻弹管底将溶液混合,6 000 rpm短暂离心。
 
(3)将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为:93℃ 2分钟预变性,然后按93℃ 1分钟,55℃1分钟,72℃1分钟,共40做个循环,最后72℃7分钟延伸。
 
七、 实时定量PCR使用引物列表
 
引物设计软件:Primer Premier 5.0,并遵循以下原则:引物与模板的序列紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
 
八、电泳
 
各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳,GoldView染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
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最新实验心得
(共4个心得)
  • jiy730

    jiy730: 荧光定量PCR内参的CT值设定

    CT值越高说明扩增的产物越多,这个方法我试过;还有就是可以在逆转录的时候增加total RNA量,一般是1000ng;镁离子浓度我没有试过,我们用的是东洋纺的SYBR MIX,就按上面的量来加,mg都是混好的。我们用的内参是18s,一般CT正常能在13,14左右。

    发表于2012-02-22 12:57

  • wqwqwqwqwqwq

    wqwqwqwqwqwq: real-time Q-PCR技术介绍

    多聚集链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术发明至今已近20年了,在这期间技术得到了不断的发展,近年来出现的实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃,它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。

    发表于2006-03-14 17:58

  • makeway129

    makeway129: 实时荧光定量PCR 的引物能不能用来做RT-PCR

    一般的RT-PCR引物是不能用来做是实时荧光定量的的引物的,但是你可以设计出兼顾二者的引物,除了要注意一般引物设计的原则外,愚见认为还要注意下两个问题: 1:设计引物扩增出来的片段一定要小一点不要超过250bp尽量在200bp以内,150bp以上 2:实时荧光定量的引物一定要更加注重它的错误引发效率,越低越好。

    发表于2008-08-01 23:05

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