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miRNA加尾法逆转录试剂盒
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999
12月
-20℃
50 Rxns×20 μL
★ 产品名称:miRNA 加尾法逆转录试剂盒★ 产品用途:适用于短片段RNA(主要为 miRNA)的加尾法逆转录反应,反应产物 cDNA 主要用于 PCR、qPCR 等反应。★ 产品描述:本试剂盒采用Poly(A)加尾反应和cDNA 合成反应同步进行的方法来进行 microRNA 第一链 cDNA 的合成,包含了与此配套的通用型 qPCR 反向引物(Universal 3’qPCR Primer), 仅需自行设计一条目的 microRNA 的特异性正向引物,就能够用于microRNA 的定量检测。具体过程是:先通过Poly(A) Polymerase 在 microRNA 的3’末端加 Poly(A)尾,再使用 Oligo(dT)-Universal Tag 通用逆转录引物进行逆转录反应,最终生成 microRNA 的 cDNA 第一链。本试剂盒为包含去除基因组 DNA 的高效 DNase的快速逆转录试剂盒,主要含有4管试剂: gDNA Remover、miRNA RT Enzyme Mix、4 × miRNA RT Buffer、Universal 3 ’ qPCR Primer。其中,gDNA Remover 中主要包括浓缩的 DNase 和 buffer,仅需室温(19 ~ 27℃) 反应 5 分钟,就能降解95%以上的基因组 DNA,极大地降低了残留基因组对结果的干扰。miRNA RT Enzyme Mix 中主要包含了Poly(A) Polymerase、逆转录酶、RNase Inhibitor。其中的Poly(A) Polymerase 不但具有高效的加Poly(A)尾效率,还特异性识别成熟的单链 miRNA,从而避免了具有双链结构的miRNA前体的逆转录反应;逆转录酶采用新型M-MLV 突变体逆转录酶,具有很强的抗干扰能力及扩增能力,扩增效率优异。4×miRNA RT Buffer 包含了miRNA 加 Poly(A)尾反应和逆转录反应的所有原料和引物, 包括 Oligo(dT)-universal tag 通用逆转录引物、 buffer 和 dNTPs,并经过精心优化,可保证 miRNA 3’末端的 Poly(A)修饰过程和逆转录过 程同时高效进行。
★ 产品组分:
★ 产品优势:● 专注于外泌体提取和配套试剂盒研发;● 性价比高,为您的研究开展节省成本;● 数百篇参考文献让您放心使用无忧购;★ 质控数据
★ 产品使用:使用前将各组分从冰箱中取出,冰上融化, 上下颠倒5 ~ 10次使之充分混匀,然后使用离心机短暂离心将管壁上附着的液体甩下来, 置于冰上待用。去除基因组DNA反应1、 用gDNA Remover处理RNA:取100 ng ~ 1 μg总RNA或者10 ng ~ 20 ng miRNA(一 般建议用0.5 μg的总RNA),加入1 μL的 gDNA Remover(如果RNA浓度较高,加入 后体积少于5 μL,则需要加ddH2O至5 μL), 用移液器轻柔吹打5 ~ 10次混匀,室温(19 ~ 27℃)反应5分钟,置于冰上待用。逆转录反应2、 按照如下体系配制加尾和逆转录同时反应体系:
3、 按照上表加好试剂后,必须用移液器轻柔吹 打10次充分混匀(注:移液器体积可调到18 μL进行吹打)。4、 逆转录反应程序:37℃反应15分钟,42℃反 应10分钟,95℃反应3分钟,即可得到包含 所有miRNA的cDNA第一链。5、 逆转录反应得到的 cDNA 可直接作为模板进 行qPCR反应,或者稀释5 ~ 10倍后再使用 (具体的稀释倍数根据基因表达丰度来确 定);如果模板cDNA不稀释,一般20 μL qPCR反应体系建议使用0.4 μL的cDNA (0.2 ~ 0.8 μL);如果模板cDNA稀释5倍, 一般20 μL qPCR反应体系建议使用2 μL的 cDNA(1 ~ 4 μL);如果模板cDNA稀释10 倍,一般20 μL qPCR反应体系建议使用4 μ L的cDNA(2 ~ 8 μL)。如不立即进行qPCR 实验,建议将cDNA冻存于-80℃冰箱中。microRNA 的 qPCR 上游引物的设计:1、 在microRNA数据库网站(例如miRBase, 网址:http://www.mirbase.org/)上搜索得 到目的microRNA成熟体序列。2、 复制目的microRNA序列,将其中的U改成T, 然后去掉3’端的最后6个碱基。3、 在5’端加上3 ~ 6个碱基(目的是提高引物 的Tm值,加入的序列以GC为主,例如 CGGGC,GCGGGC,A/TGCCCG等),使上 下游引物的Tm值相近,得到最终的正向引物 序列。常见的注意事项、操作要点及优化方法:1、 实验开始前首先验证qPCR引物是否适用,标 准与上述标准类似,主要观察扩增曲线与熔 解曲线;2、 引物验证后应该分装冻存,防止污染或降解;3、 microRNA的质量及cDNA的质量对qPCR的 结果具有很大的影响,应尽量保证 microRNA不降解。RNA提取后应尽快进行 逆转录反应,避免反复冻融,或者多次逆转 录反应。如果预计使用量较大,则可以一次 多逆转录几管cDNA。如果条件允许,cDNA 建议保存在 -80℃ 冰箱。
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