5. PCR假阳性结果
(1)引物设计不当,应调换引物。
(2)循环参数不合适,导致非特异性扩增。
(3)靶序列的交叉污染。
6. PCR假阴性结果
(1)引物长度不够。
(2)试剂浓度不标准。
(3)靶序列如突变、缺失等。
(4)循环参数设置错误。
(5)标本中有Taq酶抑制剂。
(6)PCR产物检测系统灵敏度不够。
三、PCR经验总结
1. 增加PCR的特异性
(1)引物设计
这是最重要的一步。理想的,只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件:
a 足够长,18-24 bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量;
b GC% 40%~~~~60%;
c 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性;
d 避免3'端GC 富集, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GC;
e 避免3'端的互补,否则容易造成二聚体。
f 避免3'端的错配;
g 避免内部形成二级结构;
h 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端,,在算Tm值时不需要加上这些序列,但在检测互补和二级结构是要加上它们;
i 需要使用兼并引物时,要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用较高的引物浓度(1 uM-3 uM);
j 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.
* 引物的另一个重要参数是熔解温度(Tm)。这是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火, 同时还要足够高,以减少非特异性结合。合理的退火温度从55 ℃到70 ℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5 ℃。
设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交,适用于小于18碱基的引物。有的是根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和 相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同,Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值,所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5 ℃,以2 ℃为增量,逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果,两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5 ℃,就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同,将退火温度设定为比最低的Tm低5 ℃或者为了提高特异性,可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环,然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
(2)引物的稳定性
定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物,使其最终浓度为100 μM。TE比去离子水好,因为水的pH经常偏酸,会引起寡核苷的水解。 引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20 ℃。以大于10 μM浓度溶于TE的引物在 -20 ℃可以稳定保存6个月,但在室温(15 ℃到30 ℃)仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20 ℃保存至少1年,在室温(15 ℃到30 ℃)最多可以保存2个月。
(3) 优化试剂浓度
a. 镁离子
Mg离子的作用主要是 dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用并能影响Polymerase的活性一般的情况下 Mg的浓度在0.5-5 mM之间调整同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度对实时定量PCR,使用3到5 mM带有荧光探针的镁离子溶液。
b. 其他的离子
NH4+ K+都会影响PCR。增加K+的浓度后,会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度,从而降低了PCR的严谨性(stringency)。NH4+也有相同的作用.。MBI公司的TAQ酶就提供了两种BUFFER,一种是加Mg的一种是已经混合了(NH4)2SO4的。当然, 过高的阳离子浓度(KCL>0.2 M)时,DNA在94度根本不会发生变性,当然也就无从谈起PCR了。
c. 聚合酶
不同公司的酶效有所不同,需要实验者自己掌握适合的酶的浓度。一些高保真酶的效率要远远低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些。另外, 一般的情况下,变性的温度可以使用90~92度,变性的时间也可以缩短,从而保证聚合酶的活性。
d. 模板
50ul PCR SYSTEM
human gDNA 0.1 ug-1 ug
E.Coli 10 ng-100 ng
LamadaDNA 0.5 ng-5 ng
Plasmid DNA 0.1 ng-10 ng
(4)温度
a. 变性
常规是94度5分钟,GC 富集的摸板是95度5分钟,除了GC富集外,常规的操作可以将这部分时间缩短到1到2分钟,或者在循环1时给予较长的时间,而取消开始的变性。
b. 退火
重点到了。一般情况下,是从55度开始,根据情况配合以Mg离子浓度进行调整。有条件的可以做梯度pcr。 退火的时间在30-60 S,时间短一些可以得到更好的效果。因为聚合酶在退火温度时时也会有一些活性。所以在A.T.的时间过长,会极大的增加非特异性扩增的风险。另外,在对于一些困难户,比如从gDNA里扩增大片段,还可使用二步PCR。
(5)touchdown PCR
原理很简单,但的确是一个很有用的方法。举个例子就OK,退火温度55度
94 5 min
94 30 s
60 30 s
72 1 min 2cycles
94 30 s
59 30 s
72 1 min 2cycles
94 30 s
58 30 s
72 1 min 2cycles
........
94 30 s
51 30 s
72 1 min 2cycles
94 30 s
50 30 s
72 1 min 20cycles
72 5 min