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四、其它PCR检测方法
(一)两步法
是指在用套式PCR方法扩增某些含量低微的标本时,两对引物在同一个管中以简化步骤,减少污染。通常第一步进行20-25个循环,扩增外引物片段;第二步再进行10个循环,扩增内引物片段。两步法对内外引物的Tm值有特殊要求,即内外引物的退火温度高(如68℃),在此温度下内引物不与模板退火,然后降低退火温度(至55℃)再扩增内引物片段,这样,在操作过程中,仅打开PCR反应管一次,大大减少了污染的可能性。
(二)荧光法
亦称荧光PCR技术(fluoresence PCR, F-PCR),是1995年由美国PE公司首先研制成功的,它融汇了PCR的灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点,电脑同步跟踪,数据自动化处理,直接探测PCR过程中的变化以获得定量的结果,不需要做PCR后处理或检测,完全闭管操作。探针标记除用TET和FAM外,还可用HEX、JOE作为报告荧光,3′端的淬灭基团常用TAMRA。在探针保持完整时,荧光报告基团的荧光被荧光抑制基团淬灭,而在探针被切断后,荧光报告基团才发出报告荧光,且荧光的强度与PCR产物的数量呈正比。荧光检测仪器透过PCR管壁能直接检测到荧光信号的波长和长度变化。
主要有以下优点:
1、探针特异性强,假阳性率低。
2、操作快速,不需要PCR后处理。
3、定量范围宽,HBV 0.4fg-4000fg/ml(102-106 Dane′s particle/ml)。
4、闭管操作,PCR产物污染少。
5、灵敏度高。
主要方法有:
1、荧光探针法:进行荧光PCR检测时,要求荧光探针必须完全与靶基因互补,长度以20-30个碱基为宜,必要时3′端磷酸化封闭,以防在扩增时作为引物延伸。该方法利用Taq酶的3′→5′聚合酶活性及5′→3′外切酶活性,可以在链延伸过程中实现链替换,并将被替换的探针切断,故可进行定性与定量检测。
荧光探针5′端标记的TAMRA,在480nm激发下产生530nm的红色荧光;3′端标记的FAM,激发后产生绿色荧光。PE公司推出的TaqMan系统,即采用双荧光探针,如配合使用PCR扩增与荧光检测合二为一的仪器,可进行实时(real-time)定量检测。
2、分子信标法:分子信标(molecular beacon)是一个发夹样结构的特异探针,其环状部分与靶序列互补。在室温时,分子信标的发夹紧闭,荧光淬灭。PCR扩增时,随着温度升高,发夹松开,与单链模板特异结合,发出荧光。荧光强度与模板呈正比,故可用于PCR产物的定性及定量。
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电泳时条带跑出凝胶,是什么情况?
电泳时条带跑出凝胶,是什么情况?不会没成功吧?
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双非博士真就如大家所说没有出路?
双非博士一枚,在老师的指导下,自己也算勤奋,发了三四篇SCI,其中有一篇顶刊,手头上还有一些工作没有处理完,本来心里有些自卑,面对现在外界所说双非博士的各种言论,导致自己有些不知所措。以后进高校,哪怕你有好文章也是会四处碰壁嘛?想问问过来人的经验。
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PCR有产物但是电泳无结果
PCR后用紫外分光测定DNA含量都在450-500ug/ul,但电泳无目的片段的条带,内参也没条带。电泳中maker能跑出条带,用引物也点了样,引物的条带稍模糊但还是有,请问是哪里出了问题?
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