PCR技术原理、实验步骤和应用
一、实验目的1.掌握聚合酶链式反应的原理。2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。二、实验原理PCR技术,即聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年(1993年获诺贝尔化学奖)建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍,这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子 ...
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OD260/OD280比值的问题
DNA纯度的判断根据OD260/OD280的比值判断,符合要求纯度高的纯化DNA其OD260/OD280在1.6~1.8之间,低于此范围表明蛋白质含量超标,高于此范围表明样品中含有RNA。一般机器给出的比值是分子分母同时减OD320所得,你可以自己算一下OD260/OD280,如果在要求的范围内,说明你的OD320偏高,即可能有有机物污染,比如酒精未充分挥发。纠正一下,纯DNA的A260/A ...
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PCR引物设计原则
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。因此,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它。如这一段不能形成二级结构,那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15-30碱基,扩增片段长 ...
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PCR反应程序
1.常规程序将PCR反应所需的成分配置完后,在PCR仪上于94-96℃预加热几十秒至几分钟,使模板DNA充分变性,然后进入扩增循环。在每一个循环中,先于94℃保持30秒钟使模板变性,然后将温度降到复性温度(一般50-60℃之间),一般保持30秒钟,使引物与模板充分退火;在72℃保持1分钟(扩增1kb片段),使引物在模板上延伸,合成DNA,完成一个循环。重复这样的循环25~35次,使扩增的DNA片段 ...
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