MSO要求预先设计一对含有2个不相邻的GC(或AC)的探针,用于识别甲基化和非甲基化的序列,其中含GC的探针(5[42]'---GC---GC---3')识别甲基化序列,含AC的探针(5'---AC---AC---3')识别非甲基化序列,探针的5'端通过Linker固定于玻璃板上。首先对待研究片段用重亚硫酸盐处理,将非甲基化的胞嘧啶变为尿嘧啶,甲基化的不变,再行PCR扩增,产物的3'端用荧光素标记,移至连有探针的玻璃板上进行杂交,通过检测杂交后产生的荧光强度判断待测序 列中甲基化的水平。此方法一定要设立对照。该法可用于多样本、多位点甲基化的检测,样本需要量少,适于临床样本,但存在假阳性问题。
2.2.11 甲基化敏感性斑点分析(methylation sensitive dot blotassay,MS-DBA)
G Clément等2005年[43]报道了一种新的方法,能够定量或半定量分析样本中的甲基化水平。这个方法的过程是:先用重亚硫酸盐处理待测DNA 片段,随后以非CG区的引物行PCR扩增,将扩增产物变性后转移到尼龙膜上,用3'端DIG标记的含有2个CG(或TG)的双核苷酸探针与DNA 杂交,随后用带有荧光标记的抗DIG抗体与之反应。与双CG的探针获得杂交的标本含有甲基化,而与TG探针杂交的标本未被甲基化。通过比较斑点上荧光的强度测定甲基化水平。
这种方法的优点是快速、简便、易于掌握,可一次检测多种样本,包括石蜡包埋样本。缺点是:1.检测序 列不能过长;2.若探针错误杂交或重亚硫酸盐处理不完全,则可能出现假阳性或假阴性结果。
2.2.12 甲基化特异性多连接依赖性探针扩(Methylation-Specific multiplex ligation-dependent probe amplification,MS-mlPA)
Anders O.H.等2005年改进mlPA[44]为MS-mlPA[45]用于检测特异位点的甲基化。MS-mlPA中,针对甲基化的和非甲基化的位点分别设计两个探针,每个探针都包括两个寡核苷酸部分,其中短的部分由合成产生,长的部分来源于phageM13的衍生物,后者有一个非杂交填充片段,不同探针其长度不同。探针的两个寡核苷酸杂交序列均与目标序列互补,其末端都连有相同的PCR引物。且要求[45]设计的MS-mlPA的探针要有甲基化敏感的限制性内切酶HhaⅠ(GCGC)或HpaⅡ(CCGG)的识别位点,这样,经探针和目标序列杂交后,降低反应体系温度,并向其中加入连接酶HhaⅠ,若原样本DNA 中含有HhaⅠ识别的非甲基化的位点,则非甲基化探针的两个寡核苷酸部分不能连接,而甲基化的探针顺利连接不被切割,在随后的PCR反应中只有两个寡核苷酸部分连接后的探针才能被扩增。最后分析扩增片段,确定待研究位点的甲基化情况(具体过程见图8)。
图8:甲基化特异性多连接依赖性探针扩增(MS-mlPA)示意图。用设计好的甲基化与非甲基化的探针(探针各寡核苷酸部分含有杂交序列,不同探针其填充片段的长短不同)分别与待测DNA 杂交,结合上的寡核苷酸探针经连接酶连接,若DNA 片段中存在甲基化位点,则带有(HhaⅠ)识别位点的探针不能被切割,同理,若为非甲基化,则DNA 片段被HhaⅠ切开,且探针不能被连接,这样,在随后的PCR扩增过程中,只有连接的探针能被扩增,最后对扩增的片段进行分析,得出原DNA 中特异位点甲基化的情况(图8参考引文[45])。
这种方法的优点是:1.需要样本的数量少,由于探针具有非常短的识别序列,因此MPLA可以用于局部降解的DNA ,如从石蜡包埋的DNA 样本;2.可用于分析大量混合样本。缺点是探针连接位点受限制性内切酶位点识别的限制,且要考虑到所用酶的反应适宜温度。
2.3甲基化新位点的寻找
随着甲基化研究水平的提高,近年来,提出了以限制性标记基因组扫描(RLGS)为代表的一系列新兴的全基因组甲基化扫描分析的新技术,另如:甲基化敏感的限制性指纹谱技术(methylation-sensitive restriction fingerprinting technique,MSRF)、甲基化间区位点扩增(amplification of inter-methylated sites,AIMS)等,这些新技术的出现为甲基化胚胎发育、肿瘤细胞异常基因印记向更深层次的发展提供了有效方法学工具。简单说来,[46][47][48] 1.RLGS是将稀有切点限制酶(NotⅠ)和二维凝胶电泳相结合,与NotⅠ-Eco RV文库进行对比分析,检测、扫描全基因组甲基化的情况。它的缺点是只能分析基因组中50%左右的CpG岛;2.MSRF用到限制性内切酶,如:MseⅠ、BstUⅠ,并采用10碱基随机引物扩增差异甲基化片段,几乎可以检测全所有CpG岛,但此方法复杂、需要后续鉴定、技术难度高;3.AIMS技术采用甲基化敏感和甲基化不敏感同裂酶(isoschizomer)裂解以及接头(adaptor)引物扩增甲基化间区序列,此方法可通过接头引物控制扩增带的复杂程度,且所得片段在200-2000bp之间,可以直接到载体并测序 。优点是简单方便,可以作为全差异印记基因筛选的有效工具。