这种方法的优点有:1.方法相对简单,不需预先知道CpG位点及样本序列;2.可以进行甲基化水平的定量研究;3.需要样本量少,可用于石蜡包埋样本的分析[32]。缺点是:1.只能获得特殊酶切位点甲基化情况,因此检测阴性不能排除样品DNA 中存在甲基化的可能[5];2.由于酶和PCR的使用,只能分析一种特定序列[5]。
2.2.6 甲基化敏感性单链构象分析(methylation-specific single-strand conformation analysis,MS-SSCA)
甲基化敏感性单链构象分析(MS-SSCA)又称重亚硫酸盐甲基化-PCR-SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism,SSCP)(BiPS),由Maekawa等1999年[32]报道。方法是:先用重亚硫酸盐处理待测片段,针对非CG二核苷酸区设计引物进行PCR扩增,扩增产物变性后作非变性的聚丙酰胺凝胶电泳,由于DNA 电泳时的移动性取决于其二级结构即DNA 的空间构象,而后者又由DNA 碱基的序列决定。因此,经处理后变性的单链DNA 将停留在聚丙酰胺膜的不同位置上,这样甲基化与非甲基化的就被分离开,随后行单链构象多态性分析加以明确(见图5):
图5:甲基化敏感性单链构象分析(MS-SSCA)示意图。重亚硫酸盐处理DNA 后,设计引物(非CG二核苷酸区)对处理后的DNA 进行扩增,产物解链后行聚丙酰胺凝胶电泳,由于甲基化和非甲基化单链DNA 形成不同的空间构象,它们在电泳中移动速率不同,故出现在不同位置,从而判定待测片段中甲基化情况。
这种方法的优点是:1.能够方便的应用于任何序列的甲基化状态分析;2.能够对甲基化的等位基因进行半定量;3.可以提示甲基化状态分布的不均匀性;缺点是:1.只有甲基化水平较高的单链才能明显的区分开,而较低水平的则不易分开,有时会因甲基化的CpG位点随机和不均匀分布导致电泳条带出现拥挤、拖尾的现象,故敏感性及准确性略低;2.检测片段不宜过长。
2.2.7 甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳(methylation-specific denaturing gradient gel electrophoresis,MS-DGGE)
变性梯度凝胶电泳(DGGE)是一种能够将具有单碱基差别的DNA 分离的方法。其原理是:当双链DNA 在变性梯度凝胶中进行到与DNA 变性温度对应一致的位置时,DNA 部分解链(解链区域的长度大小不等),与每一个解链区域相对应的温度称为解链温度(T)。Tm 主要由核苷酸的序列决定,这是因为DNA 链上相邻碱基间的相互作用对稳定DNA 双螺旋起重要作用。因此,很小的变化(如单碱基变化)也会引起DNA 片段Tm 值的改变。DGGE系统中,DNA 片段在变性梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳时,由于凝胶中变性剂浓度自上而下呈梯度递增,因此,当DNA 片段到达与该区域的T值相当的某一浓度位置时,DNA 解链变为分枝状,其移动减慢,停留在凝胶的的某一位置,这样不同的DNA 片段就被分离。mAggerholm等1999年[35]将其用于甲基化的检测,先用重亚硫酸盐处理DNA 使为甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶引起点突变,这样再结合使用DGGE,经电泳分离、分析该片段的甲基化状况。
这种方法的优点是:DGGE可以用来检测出除最高温度解链区域以外的所有发生甲基化的DNA 片段,需样品量少,能较直观的显示出甲基化情况[36]。缺点是:解链温度和DGGE的变性浓度梯度需要摸索。
2.2.8 甲基化敏感性解链曲线分析(methylation-specific melting curve analysis,MS-MCA)
Worm等[37]2001年报道的MS-MCA是将DNA 经重亚硫酸盐处理与Lightcycle联用检测DNA 序列甲基化的方法。荧光素标记双链DNA 。这种方法根据检测到的荧光度对应的解链温度,判断分析研究序列中甲基化的情况。在Lightcycle过程中,随着温度升高,逐渐达到DNA 双链各解链区域的解链温度Tm,DNA 呈区域性逐渐解链,一般说来,序列中CG含量越高,对应的解链温度越高。由于非甲基化的胞嘧啶经重亚硫酸盐处理后变为尿嘧啶、PCR后变为胸腺嘧啶,故其所在序列中的CG含量降低,热稳定性降低,解链温度降低。而甲基化