关键词: DNA甲基化
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图6:甲基化敏感性解链曲线分析(MS-MCA)示意图。完全非甲基化时,解链温度低(如A);完全甲基化时,解链温度高(如B);当等位基因的甲基化的发生集中于一条链或等位基因甲基化嵌合分布时,解链温度改变(如C、D)(图6参考引文 [37])。
图7:甲基化程度与解链温度关系示意图。p15Ink4b基因的荧光解链曲线,重亚硫酸盐处理HL-60(曲线a,完全未甲基化的)和MOLT-4(曲线b,完全甲基化的)这两个细胞系及取自慢性髓性白血病病人骨髓细胞中p15Ink4b的基因(其曲线为c和d,示部分甲基化的)。曲线a、b、c、d的解链峰值分别为81.3℃、88.9℃、84.4℃和86.2℃(图7参考引文 [37])。
这是一种能对甲基化分布不均匀的DNA 样本进行半定量分析的方法。缺点是:1.它不能够精确检测甲基化的具体位点;2.研究序列的长度不宜过长;3.该法对低水平的DNA 甲基化敏感性低[37]。
2.2.9 荧光法(Methylight)
Eads等[38]2000年报道的荧光法利用实时PCR(Real-time PCR)测定特定位点甲基化的情况。其过程如下:先用重亚硫酸盐处理待测DNA 片段。设计一个能与待测位点区互补的探针,探针的5'端连接报告荧光,3'端连接淬灭荧光,随后行实时定量PCR。如果探针能够与DNA 杂交,则在PCR用引物延伸时,TaqDNA 聚合酶5'到3'端的外切酶活性会将探针序列上5'端的报告荧光切下,淬灭荧光不再能对报告荧光进行抑制,这样报告荧光发光,测定每个循环报告荧光的强度即可得到该位点的甲基化情况及水平;同理,若标记的探针未能与DNA 杂交,则引物延伸不能跳过未甲基化位点,报告荧光不被切下,不发光。同样方法,也可对引物进行荧光标记,并通过不同标记的组合,检测多个位点的甲基化水平[39]。
高敏感、快速是本方法最显著的特点,它可以在非甲基化等位基因超出10000倍的情况下精确的检测到甲基化的等位基因并定量,而且可以做多样本、多基因位点的快速分析。此外其具备可重复、所需样本量少、不需要[12]电泳分离的特点。它可以为临床标本的分子生物学研究提供可靠的技术支持。缺点是费用高,测定每个位点都要用两端标有荧光素的探针和一对引物,且受较多因素影响。
2.2.10 DNA 微阵列法
Yan等2001年[40]将以分子杂交为基础的微阵列技术应用于DNA 甲基化检测中,这种方法是基于杂交的寡核苷酸微阵列,是一种在基因组中寻找新位点的方法。包括用于整个范围内扫描的差异甲基化(DMH)杂交(Huang等1999年[41])和用于检测某个位点的甲基化特异性微阵列MSO(Gitan等2002年[42])。前者类似于mRNA 表达谱或cDNA 微阵列,是CpG岛微阵列,后者类似于寡核苷酸微阵列,是针对CpG二核苷酸位点的甲基化特异性寡核苷酸微阵列[26]。
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小树洞:你们工作后第一个月都得了多少工资呢?
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抗体保存
用奶粉或者BSA配好的一抗/二抗可以在—20度保存多久?大约几个星期还是一两个月?
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DNA提取有杂带
PCR产物用试剂盒回收的时候,发现有杂带?有哪些办法可以提取得更干净?
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